弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

要約

弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。

要約

このような小さなコロイド粒子であり、最も生物細胞のような弱散乱オブジェクトは、しばしば顕微鏡法で遭遇する。実際に、技術の範囲は、これらのより良好な位相物体を可視化するために開発されている。位相コントラストおよびDICは、コントラストを増強するための最も一般的な方法の一つである。しかしながら、外撮像面内方向の記録位置や形状が困難なままである。このレポートには、正確にデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）を使用して、場所と3次元のオブジェクトの形状を決定するための簡単​​な実験方法を紹介します。大まかに言えば、アクセス可能なサンプル容量を、横方向にカメラセンササイズ、および軸方向に、照明のコヒーレンスによって定義される。典型的なサンプル量は、LED照明を使用して200 ミクロン ×200 ミクロン ×200ミクロンから、の範囲レーザ照射を用いて5 ミリメートル×5mm角以上である。平面波が試料に入射するように、この照明光は、構成されている。サンプル容積内のオブジェクトは、次いで、照明方向に垂直な干渉パターンを形成する非散乱光と干渉する、光を散乱する。この画像（ホログラム）は、3次元再構成に必要な奥行き情報を含み、例えば、CMOSまたはCCDカメラなどの標準的な撮像素子上に撮像することができる。バックレイリー·ゾンマーフェルト伝搬法を数値顕微鏡画像をリフォーカスするために使用され、グイ位相に基づいて単純な撮像ヒューリスティックは、異常再構成されたボリューム内の散乱物体を識別するために使用される。このシンプルでありながら堅牢な方法は、顕微鏡の試料内のオブジェクトの位置や形状の明確な、モデルフリー測定、その結果。

概要

デジタルインラインホログラフィ顕微鏡法（DIHM）は、標準的な顕微鏡のセットアップへの最小限の変更で、微生物^1,2とソフト物質系^3,4水泳などの微細なサンプルを迅速に3次元画像化することができます。本論文ではDIHMの教育的なデモは、当社の研究室で開発されたソフトウェアを中心に、提供されています。本稿では、顕微鏡のセットアップデータの取得を最適化し、3次元データを再構成するために記録画像を処理する方法の説明が含まれています。ソフトウェア（DGグリアら⁵によって開発されたソフトウェアに一部基づいて）および実施例の画像は、当社のウェブサイト上で自由にご利用いただけます。説明は、顕微鏡を構成するホログラムから三次元ボリュームを再構成し、ソフトウェアパッケージのトレース自由線を用い、目的の結果としてのボリュームをレンダリングするのに必要なステップが設けられている。論文は、再構成の品質に影響を与える要因についての議論で締めくくりと競合する方法とDIHMの比較。

DIHMが（キム^6を参照して、その原則と発展の全般的なレビューのために）いくつかの時間前に説明したが、必要な演算能力と画像処理の専門知識は、これまで主に、機器の開発を中心とした専門家の研究グループに、その使用を制限している。この状況は、コンピューティングおよびカメラ技術における最近の進歩に照らして変化している。近代的なデスクトップコンピュータを簡単に処理し、データストレージ要件に対応できる、CCDまたはCMOSカメラは、ほとんどの顕微鏡ラボに存在し、かつ、必要なソフトウェアは、技術の開発に時間を投資しているグループが、インターネット上で自由に利用できるようにされています。

様々なスキームは、三次元試料体積に微視的オブジェクトの構成を撮像するために提案されている。これらの多くは、画像のスタックがmで記録された技術は^7,8、スキャンするechanically試料を通って像面の翻訳。共焦点蛍光顕微鏡をスキャンすると、おそらく最も身近な例である。典型的には、蛍光染料は、サンプルコントラストの許容レベルを達成するために、位相物体に添加し、共焦点配置は、空間的に蛍光発光を局在化するために使用される。この方法は、混雑したシステム^9-11の三次元ダイナミクスへのアクセスを許可しているコロイド科学において、例えば有意な進歩をもたらした。ラベルの使用は、蛍光共焦点顕微鏡とDIHMの重要な違いですが、2つの技術のその他の特徴は、比較する価値があります。 DIHMは装置が可動部品を持たないという点で重要な速度の利点を持っています。共焦点システムにおける機械的な走査ミラーは、データ取得速度に上限を置く - 512×512ピクセルの画像のための、典型的には約30フレーム/秒。異なる焦点面からのような画像のスタックは、物理的に：訳で得ることができる30フレームスタック毎秒約1ボリュームの最終的な捕捉率につながる、フレーム間の試料ステージや対物レンズating。比較において、現代のCMOSカメラに基づいて、ホログラフィシステムは、同じ画像サイズと解像度で2000フレーム/秒をキャプチャすることができ、各フレームはサンプルボリュームの独立したスナップショットを与えるためにオフライン `'を処理する。繰り返しになります。システムは、蛍光被写体¹²のホログラフィック再構成を実行するように開発されてきたが、蛍光サンプルは、DIHMには必要ありません。ならびに三次元ボリューム情報は、DIHMも定量的位相コントラスト画像^13を提供するために使用することができるが、それは、ここでの議論の範囲外である。

生DIHMデータ画像は2次元であり、いくつかの点で、焦点の外ではあるが、標準的な顕微鏡画像のように見える。 DIHM標準明視野顕微鏡の主な違いは、オブジェクトを囲む回折リングにあるInの視野は、これらは、照明の性質によるも​​のである。一般的に、LEDまたはレーザー - DIHM明視野よりも多くのコヒーレント光源を必要とします。ホログラムの回折リングは、三次元画像を再構築するために必要な情報が含まれている。ダイレクトフィッティングと数値リフォーカシング; DIHMデータを解釈するには、2つの主要なアプローチがあります。最初のアプローチは、回折パターンの数学的形式が予め^3,4において知られている場合においても適用可能であり、この状態は、球、円柱、および半平面上の障害のような単純なオブジェクトの一握りによって満たされる。直接フィッティングはまた、オブジェクトの軸方向の位置が既知である場合に適用され、画像は、画像テンプレート¹⁴のルックアップテーブルを用いて取り付けることができる。

第二のアプローチ（数字リフォーカス）がむしろ一般的であり、数値的に光場を再構成するために、二次元画像のホログラム回折リングを使用に依存しているサンプル量全体（任意間隔）フォーカルプレーンの数。いくつかの関連するメソッドは、この^6を行うために存在し、リーとグリア⁵で説明したように、この作品は、バックプロパゲーション法をレイリー·ゾンマーフェルトを使用しています。この手順の結果は、手動で顕微鏡の焦点面（名前の由来 `数値リフォーカシング '）を変更した場合の効果を再現する画像のスタックです。画像のスタックが生成されると、焦点体積内の被写体の位置を得なければならない。このような局所強度分散または空間周波数コンテンツとして画像解析ヒューリスティックの数は、試料¹⁵中の異なる点で焦点の鮮明度を定量化するために提示されている。特定の画像メトリックが最大化​​（または最小化）されたときにそれぞれの場合において、オブジェクトが焦点にあると考えられる。

オブジェクトが「ピントが合って」で、特定の焦点面を識別しようと他の方式とは異なり、この作品における方法は、pを選び出す焦点面の広い範囲で延長することができる対象となる物体の内側にあるoints、。このアプローチは、被験体の広い範囲に適用可能であり、そのような棒状コロイド、細菌の鞭毛鎖または真核生物のような拡張され、弱散乱サンプル（位相物体）に特に適している。物体が焦点面を通過する際にこのような試料では、画像のコントラストが変化し、それが他にある場合、オブジェクトが焦点面と暗い中心の一方の側にある場合、デフォーカス画像は、光の中心を有する。彼らは焦点面に正確に位置したときの純粋な位相物体なしコントラストがほとんどを持っている。コントラスト反転のこの現象は、他の著者によって^16,17について議論^し 、異常¹⁸グイ相へ、最終的に起因しているされています。これは他の場所で、技術の限界が評価される場所ホログラフィーの文脈で、より厳格な立場に置かれています。位置の典型的な不確実性は、EACさ150nm（約1ピクセル）のオーダーであるH方向^19。グイ相が異常方法は、三次元で拡張されたオブジェクトの構造を決定するためのいくつかの明確に定義されたDIHM方式の一つであるが、それにもかかわらず、いくつかのオブジェクトが再構成する問題がある。 （カメラを指差し）を光軸に沿って直接うそのオブジェクトを正確に再構築することは困難である。オブジェクトの長さと位置の不確実性が大きくなる。この制限は、ホログラムを記録する画素の制限されたビット深度（カメラが記録することができる別個の階調数）に一部である。対象とする物体が焦点面に非常に近い場合に、別の問題の設定が行われます。この場合、対象物の実および仮想イメージは解釈が困難である複雑な光学場を生じさせる、近接して再構築さ​​れる。ここ二、やや少ないの重要な関心事は、得られた回折縞がこの粗い粒度のINFのイメージセンサの少ないを占有していることであるormationが悪く品質の再構築につながる。

実際には、単純な勾配フィルタは、照射方向に沿った強い強度の反転を検出するための三次元再構成されたボリュームに適用される。強度は、暗い、またはその逆に光から迅速に変化する領域は、次いで、散乱領域に関連付けられる。これらの個々の寄与の合計が簡単にレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーション法を用いて反転され、全散乱場を与えるために、弱散乱体がよく、そのような要素²⁰の非干渉コレクションとして記載されている。本論文では、軸方向の強度勾配技術は連鎖球菌細胞のチェーンに適用されます。細胞体は、位相物体である（種E.コリは ​​、波長λ= 589 nmで1.384であると^21を測定した屈折率を有し、 ストレプトコッカス株は類似している可能性がある）とに接続されたブロブの高輝度鎖として現れる目勾配フィルタ後の電子の試料体積が適用された。この濾過ボリュームに適用基準閾値と特徴抽出方法は、細胞内領域に対応する体積画素（ボクセル）の抽出を可能にする。この方法の特別な利点は、それが軸方向の物体の位置の明確な再構成を可能にすることである。同様の方法が（少なくとも、顕微鏡対物レンズを通して撮像対象に近いもの、そのレコードのホログラムは、）、この変位の符号を決定することができないことに苦しんでいます。レイリー·ゾンマーフェルト再構成法もあるが、署名に依存しないこの意味では、勾配の動作は、私たちは、焦点面の上下の弱位相物体を区別することができます。

プロトコル

1。セットアップとデータ収集

1. 凍結ストック²²から連鎖球菌菌株V4051-197 KTY培地（スムーズな水泳）細胞の培養物を育てる。飽和するまで、35℃、150rpmで一晩、回転式シェーカーでインキュベートする。
2. 飽和文化500μlの新鮮なKTY培地10mlに接種。細胞はλ= 600nmで（約5×10 ⁸個/ ml）で約1.0の光学密度に達するまで35℃、150rpmでさらに3.5時間インキュベートする。
3. 運動性細胞の最終濃度を得るために、新鮮な培地で1:400に希釈する。
4. 顕微鏡スライド上に、高さが1ミリメートルの周りに（ 例えば 、石油ゼリーで充填されたシリンジから）グリースのリングを作り、中央での試料溶液の液滴を配置します。液体は、スライドとカバーガラスの両方に接触していることを確実にシールするために縁部に上部及び軽くプレスでカバーガラスを配置します。得られた試​​料室はarouでなければなりませんND深さ100〜200程度である。
5. ガラスとレンズとの間にオイル中の気泡の形成を防止するために、慎重に下向きにカバーガラスを顕微鏡で試料室を配置し、。
6. 試料室の底面に顕微鏡の焦点を、そして集中する凝縮をもたらす。
7. 標準照明の電源を切り、顕微鏡のコンデンサー絞りの後ろにLEDヘッドを配置します。最大出力につながった電源装置を設定します。
8. 最大限に収束絞りを閉じ、照明は、対物レンズの開口の中央に来るよう、必要であれば、そのマウントのLEDを微調整。
9. パソコンとカメラの電源を入れ、そして、顕微鏡のカメラポートにすべての光の方向を変える。画像取得ソフトウェアでフレームレート及び画像サイズを調整する。
10. まだ良好なコントラストを維持しながら、可能な限り短いフレーム露光時間を作る。画像がな飽和ではないことを保証するために、画像輝度ヒストグラムをチェックするテッドまたは露出不足。
11. 必要に応じて、関心のある対象を少し（10〜30ミクロンで、通常）デフォーカスされるように、顕微鏡に再び焦点を合わせる。オブジェクトとは、焦点面（焦点面が試料室の内部にあるべきである、すなわち、）同じ培地であるべきである。

2。再建

処理データの最初のステップは、数値的に画像のスタックを生成する、異なる深さの一連のビデオフレームをリフォーカスすることである。これを行うためのユーザーフレンドリーなソフトウェアは、ここで見つけることができる： http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html例画像（倒立顕微鏡を用いて取得し、60X油浸対物レンズ）と一緒に光線のためのシーンファイルは、レンダリングを追跡した。

1. インターフェイス上の関連するボックスに入力着目フレームおよび個別の画像ファイルとしてのそれぞれの背景。背景イメージは、そのFフレームですエアリーホログラムの非存在下で、映像の背景を表しており、ホログラム局在化および分析を妨害する可能性の固定パターンノイズを抑制するために使用される。
2. プログラムを実行する前に、画面の左側にあるグローバル設定ボックスに値を入力します。最初の3つは、出力スタックパラメータである：最初のフレームの軸方向の位置（ '焦点を起動'）;再構成されたスタック内のスライスの数（ 'ステップ数'）;スタック内の各スライス間の軸方向の距離（「ステップサイズ」） 。
3. 正しい比率でオブジェクトを再構成するために、ステップサイズは横方向の画素間隔と同じ大きさであるべきである。 「ピクセル/ミクロン」のボックスは、最後の2ボックス内の照明波長と中屈折率で、カメラの横のサンプリング周波数（1/pixel間隔）を入力します。プログラムのデフォルト値は、例えば、データを再構成するのに適している。
4. 「フリップZ傾斜」ボタンを押すと+で記述されたクラスライブラリの中心CTはホログラムに暗くなる（例えば、フレーム2005やより詳細な情報については議論のセクションを参照）。
5. オン/オフ状態のバンドパスフィルタをチェックします（デフォルトはオン）。勾配フリップスイッチの下のボックスにあり、このオプションのバンドパスフィルタは、ノイズの多いピクセルからの寄与を抑制するための責任があります。バンドパスフィルタを直ちに生成した後、各画像スライスに適用される。
6. オン/オフ状態（デフォルトはオン）上の中間出力スイッチをオンにします。中間解析の手順が圧縮されていないとして、2出力ビデオで書かれているAVIファイル：。 'で終わる最初のリフォーカススタック（' _stack.avi 'で終わるファイル名）であり、二つ目は、軸方向勾配操作後にスタックです（ファイル名_gradient.avi '）。理想的には、この第二のスタックは、対象となる被写体が暗い背景に対して明るい被写体として強調含まれています。
7. メインウィンドウですべてのパラメータを押し「ファイル名を指定して実行」を設定した後。選択したフレームは、本ソフトウェアのメイン·ボックスに表示されます。
8. 使用（左クリック）にズームインし、（+左クリックをシフト）ズームアウトするイメージの左にあるツールバーに虫眼鏡ツール。関心領域（ROI）を選択するために、ツールバーの矩形ツールを使用してください。これは再構築を最適化するように、長方形の中に可能な限りのホログラムの干渉縞のような多くをキャプチャします。
9. 2画像スタックを生成するために、「プロセス」ボタンを押してください。 （で無料で取得することができるのImageJ使用して結果のスタック点検しhttp://rsb.info.nih.gov/ij/を ）。関心のある物体がはっきりと勾配画像スタックに見られる場合には、物体座標を抽出するために、次のステップに進む。

3。レンダリング

1. フレーム再集束に加えて、このプログラムのx、y、zは、関心対象の各ボクセルの座標を見つけることができる。この機能を有効にするには、「特徴抽出」ボタンを押してください。
2. のために、（ホームの output.inc ：C：など）拡張子を含むパスを入力してください出力は、ファイルを調整します。 「出力座標スタイル 'ボックスに「POV-Rayのスタイル」を選択します。これは、プログラムが（から取得することができる無料のPOV-Rayのレイトレーシングソフトウェアパッケージを用いて可視化することができるオブジェクト·ファイルの書き込みさせhttp://www.povray.org/を ）。
3. 上記のセクション2のように、画像を再処理します。プログラムは、「出力座標」ボックスにファイル名に書き込む（x、y、z）の一連の選択されたROI座標を提供する。オブジェクト座標の抽出はスタックの世代よりもはるかに長い時間がかかります。
4. 座標は単に生成されたファイルとして（再コードに付属）サンプルPOV-Rayのファイルが同じフォルダにあることを確認してください。サンプル。POVファイルを編集し、行に引用符でファイル名を置き換える
   ＃ "はてmyfile.inc」を含む
   再構成コードによって生成されたデータファイルの名前を持つ。
5. ビットマップ画像を描画するために、POV-Rayの中で「ファイル名を指定して実行]ボタンをクリックします。 T彼はカメラ位置、照明やテクスチャのオプションは、POV-Rayの中で可能なカスタマイズのほんの一部です。詳細については、オンラインマニュアルを参照してください。

結果

DIHMの能力を実証するために、実験は、 ストレプトコッカス属細菌の鎖上で実施した。チェーン自体は長い10.5ミリメートルを測定し、範囲0.6〜1ミクロンの直径を有する6-7球面円柱細胞（チェーン内のセルの2が分裂に近い）から構成されていた。 図1aおよび1bのショーのメインインタフェースを復興とレンダリングソフトウェアの。数値的再集束手順の例は、?...

ディスカッション

この実験プロトコルの中で最も重要なステップは、安定した実験装置からの画像の正確なキャプチャです。貧しい背景データと、高忠実度の再構築は不可能に近い。これは、再構成された画像を劣化させることができるように、（対物レンズの背面から見て暗色年輪として可視）内部位相差素子と対物レンズを回避することも重要である。関心のあるオブジェクトは、回折縞のいくつかのペ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362