老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

要約

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。

要約

ヒトの細胞は無限に増殖しない。外部および/または内因合図すると、細胞が老化と呼ばれる安定した細胞周期の停止を死ぬか、または入力します。このようなテロメアの短縮やマイトジェン癌遺伝子の異常発現などのいくつかの細胞のメカニズムは、老化を引き起こすことが示されている。老化は、正常細胞に限定されず、癌細胞はまた、老化することが報告されている。

化学療法薬は、癌細胞の老化を誘導することが示されている。しかし、それは老化が防止または腫瘍形成を促進するかどうか議論の余地がある。それは最終的に患者固有のかもしれないような、癌細胞の老化を評価するための迅速かつ高感度の方法はすぐに必要とされる。

この目的のために、標準的なβ-ガラクトシダーゼアッセイを、現在使用されている方法は、主要な欠点​​を提示する。それは時間がかかり、敏感ではない。ここではリチウムの老化を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを提案セルをVEの。このアッセイは、感受性、迅速であるという利点を提供し、種々の細胞マーカーの免疫標識に結合することができる。

概要

60年代前半とヘイフリックとムーアによるその発見以来、老化はまだ携帯好奇心¹のままです。ヒトの細胞は無限に老化によって、ヘイフリックとムーアは老化の細胞プロセスを造語、増殖しません。老化は、細胞死とは対照的に、細胞は代謝的に活性なままである、安定した細胞周期の停止である。テロメアの短縮、DNA損傷、クロマチン摂動、及びマイトジェン癌遺伝子の異常発現^2：日付には、4つの細胞メカニズムは老化を誘導することが示されている。これは、正常細胞だけでなく、癌細胞だけでなく老化^3を受けることができることを示している。実際のところ、老化を受けている癌細胞をさらに腫瘍進行^4-5に対する障壁を構成することが示された。しかし、いくつかの報告は現在、特定の状況下で、細胞老化にも悪性^6-7を促進することができる、と指摘している。癌CELの老化を研究現在使用されている化学療法薬はin vitroにおいてもin vivoで ⁸だけでなく、がん細胞の老化につながることができるようなLSは、がん研究の衝動になろうとしている。

老化細胞の存在を調査するマスターアッセイは、酸性pHでのβ-ガラクトシダーゼアッセイである。この組織化学的アッセイは最も老化細胞で発生するリソソーム生合成増加を反映している。簡潔には、細胞に適用外因X-galのは、青色⁹を生じる、老化細胞のリソソームに富むβ-ガラクトシダーゼによって切断される。青色老化細胞は、その後、明視野顕微鏡下で定量することができる。非常に人気があるが、β-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。まず、このアッセイは、固定細胞上で実行される。それは顕微鏡下で老化細胞の有意に高い数をカウントすることによって老化の程度を定量化することを意味するので、第二に、それは時間がかかる。第三に、このアッセイ老化と非老化細胞の間に差別が完全にオブザーバーに依存しているとして区別されません。

我々はここに住んで老化細胞の存在を評価するために未開発の、迅速、かつ高感度メトリーベースのアッセイを話し合う。このアッセイは、膜透過性分子の加水分解、5 - dodecanoylaminofluoresceinジ-β-D-ガラクトピラノシド（C ₁₂ FDG）に基づいて、β-ガラクトシダーゼによる老化細胞に富む。加水分解およびレーザー励起した後、C ₁₂ FDGは、緑色の蛍光を発するため、フローサイトメトリー^10,11で検出することができる。フローサイトメトリーを介した老化細胞の検出は、迅速かつ高感度であることの大きな利点を提供しています。また、フローサイトメトリーによる老化細胞の検出は、他の細胞マーカーの検出と結合することができる。このアッセイは、化学療法で処理した癌細胞の集団内で老化細胞を検出するために使用することができ、日常的に設定することができるまで組織切片上で、携帯解離後、診療所である。

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プロトコル

1。 C12FDG、バフィロマイシンA1、および細胞培養の調製

1. 最終濃度20mMにジメチルスルホキシド（DMSO）中のC ₁₂ FDG粉末を溶解する。 -20℃でアリコートと店舗DMSOは、適切な安全条件で使用されるべきである。
2. 0.1mMの最終濃度DMSO中バフィロマイシンA1粉末を溶かす。アリコートと店で - 20℃バフィロマイシンは、適切な安全条件で使用する必要があります。
3. 37℃、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質、°C、5％CO _2を含む培地で、RPMI 8226細胞株、又は接着否か他の細胞株を養う。実験に必要なセルの数を見積もります。フローサイトメトリー分析の間に十分な数のイベントを記録するために、5×10 ^5個の細胞が必要である。老化細胞の割合を、3つの細胞サンプルが必要とされるかを判断するには、次のようにラベル付けされていないサンプル、C ₁₂ FDGで染色処理した細胞で染色した未処理の細胞をC ₁₂ FDG。
4. シードセル24時間は、従来の細胞は、細胞増殖曲線の対数期内になるように実験を行う。

2。老化の誘導

1. 化学療法薬を添加することにより癌細胞の老化を誘導する。薬物濃度と処理時間を試験した細胞タイプに適合させるべきである。約10 ⁶細胞/ mlの細胞の濃度は50 nmのドキソルビシンの最終濃度で48時間処理を開始します。未処理のサンプル（ネガティブコントロール）を含めることを忘れないでください。

3。バフィロマイシンA1治療

1. 前のステップで使用される化学療法薬は、細胞アポトーシスをもたらす可能性があるため、トリパンブルー（v / v）で混合すると細胞によって細胞生存率を確認する。 Malassez室に記入し、青色細胞（死細胞）の白と細胞（生細胞）の数を数える。生存率の割合が70％未満である場合は、死細胞は、レムかもしれない死んだ細胞はバイアスその後の分析をしないことを確保するための適切なキットを使用してoved。
2. 培地を取り出し、あらかじめ温めておいた新鮮な培地で置き換える。バフィロマイシンA1 100nMの最終濃度で細胞を扱う。バフィロマイシンA1は、リソソームの酸性pHを中和するために使用される。 37℃、5％CO ₂で1時間インキュベートします。

4。 C ₁₂ FDG染色

1. 2mMの最終濃度予め温め新鮮な培養培地中でC ₁₂ FDGを溶解する。
2. 33μMの最終濃度で細胞に化合物を添加し、37℃で2時間インキュベートする°C、5％CO _2。非接着細胞を使用する場合は、4℃で5分間300×gで細胞を遠心（速度が使用される細胞型に調整する必要があるかもしれません）、PBSで2倍を洗浄する。冷PBSの500μlの細胞ペレットを再懸濁します。接着細胞を使用している場合は、メディアを取り出し、PBSで2倍を洗う。トリプシン溶液と遠心分離機を用いて接着細胞を収穫4°Cで5分（速度は使用する細胞の種類に調整することが必要になる場合があります）、300×gで細胞。冷PBSの500μlの細胞ペレットを再懸濁します。両方の場合において、細胞濃度は、約10 ⁶細胞/ mlであるべきである。
3. さらに老化細胞の集団を特徴づけるために、共免疫標識を実行します。

5。フローサイトメトリー分析

1. フローサイトメータの製造元が推奨する対照ビーズを用いたフローサイトメーターを較正する。すべての手順については、少なくとも10の^4つのイベントが記録されなければならない。
2. ラベル付けされていない細胞を含む最初のサンプルを実行します。 2パラメータのグラフィック表示を前方散乱チャネル（FSC）対側方散乱チャネル（SSC）を準備。光電子増倍管を（光電子増倍管）を設定し、試料調製時に登場しているかもしれない死んだ細胞や細胞破片を除いた関心領域を定義します。ゲートログスケールでFL1を表示1パラメータヒストグラムの関心のこの領域x軸とy軸でのイベント数。イベントの総数は、分析された細胞の数を表す。ラベル付けされていない細胞は、x軸の対数スケールで最初の十年で表示されるようにPMTを設定します。必要に応じて細胞の自家蛍光を決定します。
3. 未処理の細胞を含む第二のサンプルを実行します。 FL1（C ₁₂ FDGの蛍光）を表示し、ワンパラメータヒストグラムに、ぼんやりとラベルされた人口の後にカーソルを置きます。このしきい値は、非老化細胞（ぼんやりと標識された細胞）と老化細胞（明るく標識された細胞）の間の区別が可能になります。
4. 処理した細胞を含む第3のサンプルを実行します。明るく標識された細胞、 すなわち老化細胞は、前の手順で決定された閾値の上に表示されます。イベントの総数当たり明るいイベント数を割ることによって老化細胞の割合を評価する。必要に応じて、β-ガラクトシダーゼ活性は、平均蛍光を用いて推定することができる強度。

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結果

多発性骨髄腫、血液学的悪性腫瘍は、化学療法によって誘導される手順老化を評価した。そのためには、市販のMM細胞株（RPMI 8226）はドキソルビシン、化学療法薬で2日間処理した。次いで、細胞をバフィロマイシンA1処理を施し、更にC ₁₂ FDGと共にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。 図1は、老化細胞の割合C ₁₂ FDGを用いて日以内?...

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ディスカッション

我々はここに住んで、癌細胞における細胞老化を定量化するためのフローサイトメトリーベースの方法を提示した。この方法は、膜透過性化合物、C ₁₂ FDGの使用に基づいており、化合物が細胞によって取り込まれているようので、任意の細胞型において及び限り、種々の処理後に使用することができる。細胞への取り込み時に、C ₁₂ FDGは、老化細胞のリソソームに富んだβ-ガ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside	Invitrogen	D-2893
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Bafilomycin A1	Sigma	B1793
Doxorubicin	Sandoz
Trypan blue	Sigma	T8154
RPMI 1640 cell culture medium	Lonza	BE12-702
Fetal calf serum	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter	A94291