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要約

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。

要約

培養中の細胞（in vitroでの解析で ）の研究では、複雑な生物学的システムに重要な洞察を提供してきました。 in vitroでの解析でするための従来の方法と装置はよくミリリットル規模な量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の多数の研究に適しています。しかしながら、関心および/またはその培養物、刺激、または処理に必要な試薬の細胞の消費を減らすために、培養規模を縮小することが必要または望ましいである多くの例がある。残念なことに、従来のアプローチでは、マイクロスケールの文化を正確かつ再現性のある操作をサポートしていないと、現在利用可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムは、あまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化されます。マイクロスケール体積 - この問題に対処するために、我々は自動化された培養物、刺激し、細胞の小集団（2,000セル100）の回収のためのシンプルかつ汎用性の高い技術プラットフォームを開発したS（1 - 20μL）。 "転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブを装備し、デジタルマイクロフルイディクス（DMF）デバイス、プラットフォームは、マイクロスケール培養物を、確立され維持され、刺激され、その中フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（"細胞灌流チャンバー "）、のセットで構成され"）、および灌流チャンバーからのルート細胞および試薬れ、パワー灌流室と中央ハブの間の材料の輸送高精度シリンジポンプ、れると、材料の輸送を制御でき電子インターフェース、ある調整し、予め決められたスクリプトを介して自動化。例として、細菌によるチャレンジに基づい免疫細胞において誘発転写応答の研究を容易にするために、プラットフォームを使用した。プラットフォームを使用することにより、私たちは、細胞や試薬の消費量を減らす実験ツー実験の変動を最小限にするために有効で、再直接ハンズオン労働。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性、Oを考えるウルプラットフォームは、研究室やさまざまなアプリケーションでの使用を見出す、とだけ数量限定で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。

概要

（in vitroでの解析では）文化の中で維持された細胞の研究では、複雑な生物学的システムと人間の健康を支配する基本的な原理と分子メカニズムに貴重な洞察を提供してきました。ペトリ皿とマイクロタイタープレートを利用して分析するための文化、刺激し、細胞の収集のための従来の方法は、ミリリットル規模な文化量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の大規模な集団の研究のために設計されていた。しかし、細胞の限られた量が使用可能な多くのインスタンスが（ 例えば、初代細胞）、または細胞の小集団（ 例えば 、集団全体のセル間のばらつきを低減する）ことが望ましい、または必要な試薬を得ることが困難であるまたは高価（ 例えば精製細胞分泌因子）。このような問題が正常に培養規模を縮小することによって対処することができ、これは、 すべての消費を低減するという利点を有している試薬は、in vitroでの解析1,2 にするために必要。残念なことに、従来の装置および方法は、マイクロスケールの文化や3-11はあまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化され、現在入手可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムの正確で再現性のある操作をサポートしていません。

マイクロスケールのボリュームで（1 - 20μL） - 本稿では、自動化された文化、刺激し、細胞の小集団（2,000細胞100）の回復のためのシンプルで汎用性の高い技術プラットフォームの組み立てと使用を説明します。フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリーが（ "細胞灌流チャンバー"モジュール）マイクロスケール文化の確立、維持、刺激のためのサイトとして機能のセット、およびデジタルマイクロフルイディクス（DMF：プラットフォーム·アーキテクチャ（ 図1）は、設計でモジュール化され"転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブ"モジュール）14,15路線細胞を装備）12,13デバイス灌流チャンバーへとからと試薬。 DMFは、ユーザが個々に、同時に複数の液滴に対応し、デバイスハードウェアを変更することなく操作（ すなわち、再構成試料処理列）を変更または再注文することを可能にする。その驚異的な柔軟性は、細胞培養16,17、酵素アッセイ18,19、20,21イムノアッセイ、DNA分析22,23、タンパク質処理、24,25など、幅広い用途でのキーテクノロジーとしての最近の出現で明らかであるおよび臨床検体処理。26,27地球中心ハブは、DMFデバイスに固有の柔軟性を利用し、さらに特化した周辺装置の操作のサブセット（ 例えば、細胞培養物）を実施する機会を提供微小インタフェースを追加することによってそれを増強するむしろDMFデバイス自体よりもモジュール。このように処理列車の区画もPLAの設計を簡素化TFORMアーキテクチャ（ すべての処理手順を実行することができるDMFデバイスを構築する必要がない）と新しい機能としての進化を促進するには（単に必要に応じて新たな周辺モジュールを統合）が必要です。から、交通機関へ、そして灌流チャンバー内で高精度な注射器で生成された圧力変化によって供給され、中央ハブ内の細胞と試薬の輸送はDMF装置13,28内の電極の逐次的活性化によって生成される力をエレクトロウェッティングにより駆動されるポンプ。これらの流体運動のすべては、単純な電子インターフェースを介して制御され、予め決められたスクリプトを使用して自動化されている。

代表的な例として、細菌によるチャレンジ（ 図2）により誘発された免疫細胞の転写応答の研究のためのプラットフォームの使用を示す。プラットフォーム上でこれらの実験を行うことは、私たちは、細胞の数が少ない（experimen あたり 〜1,000で動作するように有効にTAL条件）、実験·ツー·実験の変動、節約試薬、再直接ハンズオン労力を最小限に抑えます。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性を考えると、このプラットフォームでは、研究室や様々なアプリケーションでの使用を見つけて、限られた量で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。

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プロトコル

この一般的なプロトコルは、研究の多種多様なプラットフォームのアプリケーションをサポートするように設計されているが、この報告書に記載の代表研究に固有の側面は括弧内に分離されている図2プロトコルを使用して行う代表的な研究を示しています。プロトコルでは、すべての "指示する"コマンドはあらかじめ決められたスクリプトの使用を介して自動化されていることに注意してください。ステップ2、ステップ1（ステップ1.7と1.8の間に、例えば ）と並行して行うことができることにも注意して、そのステップ2.1は、多くの場合、バイパスされ（パターン化/コーティングされたDMFデバイスプレートを洗浄して再使用することができるので、ステップ5.2を参照のこと） 。

1。細胞灌流チェンバースを組み立て、移入

  1. コー​​ト滅菌（オートクレーブ）マイクロキャピラリー（フューズドシリカ長さ15cm;; 679μmの外径、534μmの番号）の内面無菌フィブロネクチン溶液（50μgの/ mlの30μlの）を描画するためにシリンジポンプを指示することによってフィブロネクチンと、それぞれに解決策を撤回するシリンジポンプを指示すると、マイクロキャピラリー乾燥（6時間室温（RT）を）せ、（37℃2℃時間）インキュベートし、マイクロキャピラリー。
  2. CapTite継手（6灌流チャンバー、8ポートシリンジポンプ）を使用して、ポリカーボネートの管（500μmの外径、100μmのID）とマルチポートシリンジポンプにチューブに各フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（灌流チャンバー）を接続します。
  3. テープを用いて、所望の温度（37℃）に設定したヒートブロックに各灌流チャンバーの本体を固定する。
  4. 新鮮な増殖培地（RPMI-1640、10％FBS、500単位/ mlペニシリン、500μgの中に懸濁させ、リザーバ内の灌流チャンバーの開放端（microcentifugeチューブまたはマイクロタイタープレートウェル）を含有する細胞（P388D.1マウスマクロファージ）浸し/所望の濃度（10 6細胞/ ml）でのストレプトマイシン）。
  5. 十分な愛が続く各灌流チャンバーに細胞（10μlを、10 4細胞）を描画するためにシリンジポンプを指示ヒートブロックに固定部分に液体プラグ（約4.5センチ）を移動するには、r。
  6. 細胞は灌流チャンバーのフィブロネクチンでコーティングされた内部表面（ - 2時間37℃で1）に準拠することができます。一方、セルリザーバからの新鮮な成長培地を含む新しいタンクに潅流チャンバの開放端を転送する。
  7. 遵守期間の後、無駄に新鮮な培地（10μL）を撤回し、付着した以上の新しい液体プラグ（新鮮な培地）を配置するために十分な空気に従うように液体プラグ（馴化培地と付着していない細胞）を送信するためにシリンジポンプを指示細胞。
  8. 細胞集団は、（ - 〜1,000細胞/チャンバーの集団を生成したマイクロスケールの文化の24時間16）が十分に平衡化と拡張になるまで定期的に（毎週2時間）で培地交換（ すなわち繰り返しステップ1.7）を実施し続けています。

2。 DMFデバイスを製造し、ハブ·アーキテクチャを組み立てる

    前述14,29、四十から六インジウムスズ酸化物（ITO）、フォトリソグラフィとエッチングにより電極（滴作動のドライバ）、及びパリレン-Cおよび50の5μmのとコートとパターンDMFデバイスの底板を説明テフロン-AFのNM。テフロン（登録商標）-AFでパターン化されていないITOガラス基板は、上述したように、コーティングによりDMF装置の天板を形成する。
  1. 、この間隔は、作動電極サイズ（2.5ミリメートル2）と組み合わせた液滴量（2.5μLを定義し、金属圧縮フレームを使用して、プレート間に400μmの間隔を維持する凹部を有するポリマーキャスト14,30にDMFのプレートを固定する電極当たり ）。 DMFアセンブリは単純な手段24によって達成することができることに注意してください。
  2. その同族作動電極の端まで延長し、各位置決めをDMFプレート間の空間に、 - ;インサートテフロンコーティングされた転送マイクロキャピラリー（4.0センチメートル長い3.5 OD、100μmの番号360ミクロン）。
  3. 反対ENに各転送マイクロキャピラリー接辞CapTite金具のD。
  4. ITO電極に電圧を供給するための電気コネクタをかみ合わせます。電極の活性化配列は、所定のスクリプトを実行しているコンピュータ制御された電子インターフェースの使用を介して自動化されている。
  5. オプション：液滴の追跡を容易にするために電荷結合素子（CCD）カメラ（DCR-HC96（ソニー、日本））を備えた顕微鏡の並進ステージ（SZ-6145TR（オリンパス、日本））上に組み立てられたハブDMFを移動する31

3。 DMFハブに灌流チェンバースを接続し、細胞集団を刺激

  1. 培地リザーバから灌流チャンバーの開放端を取り外します（ステップ1.6を​​参照）、（ステップ2.4​​を参照）をDMFハブの転送マイクロキャピラリーの両端に貼付CapTiteフィッティングに挿入してください。
  2. 無駄に灌流チャンバー内の液体プラグ（馴化培地）を送信するためにシリンジポンプに指示します。
  3. インストオンボードリザーバから（ 大腸菌 0.1％プルロニックF127 w / vの新鮮な培地では100μg/ mlで生体粒子）刺激を描き、微小毛細血管各転送に適切な大きさの液滴（10μL）を提供するDMFハブをruct 。オンボード·リザーバは、円筒状の区画（1.5×1.5センチずつ）で構成され、配管を介してDMFハブに接続されている。
  4. 刺激が転送マイクロキャピラリーに差し込む描き、灌流チャンバーで細胞集団上のプラグを配置するために十分な空気に従うことをシリンジポンプに指示します。
  5. 刺激（ - 4時間37℃1℃）で細胞をインキュベートする。オプション：定期的に新鮮な刺激のために為替（ つまりリピートステップ3.2から3.4）。

4。刺激を終了し、解析のための細胞ライセートを回復

  1. オプション：ポスト刺激期間が必要な場合は、（ すなわち繰り返しステップ3.2新鮮培地に対して刺激含有液プラグを交換する- 3.4、）刺激のために新鮮な培地を代入し、インキュベートし、必要に応じて交換することを続けています。
  2. 洗浄バッファー（プレリュード直接溶解モジュールバッファーB）（ すなわち繰り返しステップ3.2から3.4まで、刺激のための洗浄バッファーを代入）のExchange灌流チャンバー内の液栓、となど（5分）が必要とインキュベートする。
  3. 為替溶解溶液（プレリュード直接溶解モジュールバッファー0.1％プルロニックF127 w / v）のための液体プラグ（バッファを洗う）（ つまりリピートステップ3.2から3.4まで、刺激のために溶解液を置換）、および必要に応じてインキュベート（5分） 。
  4. DMFハブに液体プラグ（細胞溶解物）を送信するためにシリンジポンプに指示します。
  5. DMFハブを分解し、DMFデバイス（これは液滴混合になることができますように、横向きプレートを傾けないように注意して使用して）の天板を取り外し、オフプラットフォーム分析用ピペットマンや注射器を使用して溶解物（遺伝子発現プロファイリングを収集定量PCR経由）。

5。用クリーンプラットフォームハードウェア再利用

  1. 、RTで10分間、10％の漂白剤（水中v / v）で、転写マイクロキャピラリーとCapTite継手を浸す脱イオン水で十分にすすぎ、窒素ガスを用いたドライ。
  2. RTで10分間、10％の漂白剤でDMFデバイスプレートを浸し、イソプロパノールでよくすすぎ、脱イオン水に続いて、ドライ用いて窒素ガスを10分間160℃で焼成した。
  3. シリンジポンプのポリカーボネートチューブ、およびDMFデバイスのポリマーキャストと圧縮フレームは、洗浄することなく再利用することができる。灌流チャンバーマイクロキャピラリーは、各実験の後に破棄されます。

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結果

自動化されたプラットフォームの証明として、我々は、免疫細胞の小集団は、マイクロスケール培養で増殖させた細菌でチャレンジし、炎症促進性応答（ 図2のプラットフォーム外分析のために溶解しされた研究を行うためにそれを使用し）。

6セル灌流チャンバーの各々は、成長培地10μlに再懸濁し、10 4免疫細胞（P388D.1ネズミマクロファージ）を?...

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ディスカッション

私たちは、マイクロスケールの細胞培養と刺激実験のためのシンプルで汎用性の高い自動化されたプラットフォームを開発しました。文化サイズがさらに小さい直径のマイクロキャピラリーを使用することにより減少させることができる、プラットフォームは、私たちは小さな文化ボリュームと細胞集団- （ - 20μLと100 2,000細胞、室ごとに1）で動作するようになります。これらのスケ?...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

著者はDMFデバイスおよびDMFハブの設計と開発への貢献のためにロナルドF.レンツィとマイケルS. BARTSCHに感謝します。この研究は完全にサンディア国立研究所で研究所監督研究開発プログラムによってサポートされていました。サンディア国立研究所は、契約DE-AC04-94AL85000下エネルギー省の国家核安全保障管理局の米国商務省のためサンディア社、ロッキード·マーティン社の完全子会社が管理·運営、マルチプログラム研究室です。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Prelude Direct Lysis ModuleNuGEN1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v)GIBCO15250-061
Cell StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Parylene C dimerSpecialty Coating Systems28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Polyimide tapeULINES-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta TechnologiesCB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillariesPolymicro TechnologiesTSU100375
Perfusion chamber microcapillariesPolymicro TechnologiesTSP530700
Tubing and microcapillary fittingsSandia National Laboratories
Polycarbonate tubingParadigm OpticsCTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringesHamilton Company54848-01
Parylene-C vapor deposition instrumentSpecialty Coating SystemsPDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generatorTrek615A-1 615-3
MVX10 microscopeOlympusOptional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD cameraQImagingQIClick-F-CLR-12Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

参考文献

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