遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

要約

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。

要約

シロイヌナズナ胚乳は、成熟した胚を囲むと休眠種子の発芽や（FR）遠赤色光パルスで照射非休眠の種子のことを防止するための重要な役割を果たして、単一の細胞層から構成されています。さらに胚乳によって発揮される発芽抑制活性の基礎となる分子遺伝的メカニズムへの洞察を得るために、「種皮の寝具」アッセイ（SCBA）を考案した。 SCBAは種皮の下地層の上に胚の成長を監視することができ、物理的に種子から種皮と胚を分離する解剖手順です。驚くべきことに、SCBAは、種子休眠と種子発芽のFR-依存制御のコンテキストで種皮の発芽抑圧的な活動を再構成する。 SCBAは、休眠中の非休眠の遺伝子組み換え種皮と胚性材料、発芽を制御する遺伝的経路の組み合わせを使用することができ、具体的にはOP以来胚乳および胚におけるeratingを解剖することができます。ここでは詳細はSCBAを組み立てる手順を私たち。

概要

シロイヌナズナ成熟種子において、種皮は種皮、母体起源の死んだ組織の外部層と、胚乳、胚芽、直接^1を取り巻く生きている組織の単一細胞層から構成されている。胚乳および胚は、別々の受精イベントから派生されています。胚が1妊産婦と1父方ゲノム²と二倍体組織であるのに対し、胚乳は母親の2と1父方ゲノムと三倍体組織である。

伝統的に胚乳に割り当てられた主な機能は、栄養組織のものである。しかしながら、胚乳はまた、種子の発芽を制御するための中心的な役割を果たしていることがますます明らかになってきている。この概念は、休眠の場合には新たに生産、種子が示す特性最初に明らかになった。休眠種子は、良好な発芽条件が存在するにもかかわらず、発芽していない。種子は熟成期間後に休眠を失い、nondormanなる良好な発芽条件にさらされたときtは、 すなわち 、それらは発芽する。種皮の除去は、胚の成長と緑化^3,4をトリガーするため、モデル植物シロイヌナズナを含む多くの植物種では、種皮が絶対的に休眠種子の発芽を防止するために必要とされる。 シロイヌナズナにおいて、Bethke らは、発芽が胚乳^5を囲む胚乳を維持しながら種皮を除去した後に抑圧されたままであることを観察した。これらの観​​察は、胚乳が胚に対して抑制活性を発揮種皮内の組織であることを示した。しかし、種皮除去実験は必ずしも種皮が提供する発芽抑制活性の性質を明らかにしたり、それを実装する遺伝子を同定する助けていない。

我々は最近、種皮と胚を物理的に分離されますが、近いproxiに保存されてい種皮寝具アッセイ（SCBA）を導入公正妥当胚乳によって提供発芽抑制活性を⁶に維持されるようになっている。 SCBAは、休眠非休眠の、そして遺伝子組み換え種子コートおよび胚性材料の組み合わせを使用することができます。その結果、遺伝的経路の発芽を制御し、特に胚乳及び胚において動作を解剖することができる。 SCBAは胚乳⁶はその成長を抑制するために、胚に向かって植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）を放出することを示すために休眠の文脈で使用した。さらに私たちは、休眠を促進するため、胚乳や胚組織で動作してシグナル伝達経路を特定するためにSCBAを使用することができます。

発芽を制御するために、胚乳の役割は、（FR）遠赤色光のパルスにさらされる非休眠の種子の場合を考慮することによって強化された。初期の種子吸水時のFR光パルスは^7,8発芽^を阻害することが知られている。種皮は種子からのFR光のパルスを取り出した際に強く胚乳はまた、非休眠の種子の⁹の発芽を抑制することができることを示唆し、発芽を抑制することができませんでした。注目すべきことに、SCBAはまた、発芽のFR-依存性阻害を再現するために用いることができる。これは種子発芽のFR依存性阻害にも胚乳⁹からのABAの放出を伴うプロセスであることを示すことができました。さらに、SCBAは、胚乳と光の合図^9,10に対応して非休眠の種子の発芽を制御するために、胚で動作し、異なる光シグナル伝達経路を特定することができました。

SCBAは、種子発芽の制御のコンテキストで胚乳の機能を探索するために信頼性の高い技術であることがありますので。また、発芽を制御するために疑われる遺伝子は胚乳、胚または両方の組織で動作するかどうかをin vitroで評価する強力なツールです。ここでは詳細はSCBAを組み立てるために必要な様々なステップを、私たち。

プロトコル

SCBAが組み立てられると、胚の成長は、数日間にわたって監視される。したがって、SCBAのシード切開手順および組立前、人は、胚成長に対する種皮物質の効果の適切な評価を防ぐことができる将来の汚染を避けるために、種子を殺菌する必要がある。

1。種子消毒

1. 1.5ミリリットルの微量遠心管に成熟し、乾燥したシロイヌナズナの種子の50〜60μLを注ぎ、70％エタノール溶液を調製する。
2. 種子を含有するマイクロ遠心チューブに70％エタノール溶液1mlを添加し、ボルテックスミキサーで1,200 rpmで10分間室温で振盪する。
3. チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。
4. 慎重に微量遠心チューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて70％エタノール溶液を吸引する。
5. tまでの滅菌蒸留水1ミリリットルを追加彼は、マイクロチューブは、まだ種を含む。
6. 1,200 rpmで10分間室温で振盪する。
7. チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。
8. まだ種を含むマイクロ遠心チューブに滅菌水1mlの蒸留水を加える。水の流れが均一に管内の種を一時停止していることを確認してください。ここでの目標は、種子の整合性を維持するために、さらに揺れないようにすることです。
9. 種子は30秒間、まだチューブを残すことによって、チューブの底に重力によって落ち着くましょう。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。
10. 1.9 - 1.8ステップ4回繰り返します。全体的な滅菌処理には約30分かかります。

2。シードメッキ

「ontent>その後の工程は、無菌状態を維持するために、層流キャビネット内で実行されています。

1. （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES-KOH - ペトリ皿プレート2.5mMの2 4.3 g / Lのムラシゲとスコーグ培地を含む溶液をオートクレーブ処理することによって調製発芽培地30mlを含有する（直径100mm、高さ20mm）を準備; pHは5.7）と0.8グラム/ L寒天。溶液をペトリ皿プレート上に注ぐ前に、50℃の水浴で冷やす。
2. 種を含むチューブに滅菌蒸留水を200μlを加える。種を再懸濁し、1ミリリットルの先端で、標準的なピペットを用いて発芽培地の表面に転送します。
3. 真空吸引チップを用いて発芽培地の表面上に種子を周囲の水を除去する。
4. さらなる乾燥のための2時間、層流キャビネット内の蓋なしで種を含むペトリ皿にしておきます。蓋をペトリ皿を閉じて、それが層流の下に放置約4時間後には種子消毒手順（ステップ1.2）の開始から経過したように、約90分間のキャビネット流れ。

3。シード解剖

次の手順は、層流フードキャビネット内部に配置された実体顕微鏡を扱う必要とする。切り捨てられた（ すなわち鈍）チップを備えたデュモンの鉗子＃5が大幅に種子（ 図1A）の対応が容易に行えます。

1. 発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。ミディアム2並置長方形の無菌ワットマン3MMペーパー（; 図1B、ステップ1〜1.5センチメートル×1.0センチメートル）の表面に配置します。ワットマン3MM紙はオートクレーブ滅菌されています。
2. 滅菌ピンセット（ 図1B、ステップ2）を使用して、ワットマン3MMの紙に種を転送します。
3. 優しく切り捨て鉗子（の並置鈍チップを使用して、シードを押して、ワットマン3MM紙に対して個体の種子を開催図1B、ステップ3）。
4. （12.7ミリメートルのX 例：U100インスリン注射器+ 1ミリリットルの注射器、0.33ミリメートル（29 G））注射針を使用した種子の種皮（種皮や胚乳）をカットし（ 図1B、ステップ4）。 シロイヌナズナ種子の形状は楕円形であり、それは子葉（ すなわち離れてラジカル先端から）幼根に接合されている場所にできるだけ近い最長半主軸に沿って種皮をカットすることをお勧めします。これは解剖手順の次の段階で胚の安全な解放を支援します。
5. 切り捨てられた鉗子（ 図1B、ステップ5）の並置鈍チップを使用してワットマン3MM紙に対する種子を押してください。このステップは、ステップ3.4（ 図1B、ステップ6）で作成された開口部を介して、種皮から胚を解放します。これは、子葉の先端が幼根の先端に最も近い内にあるシード（ すなわち離れてFR上のプッシュを適用することをお勧めしますOM開口部）。

4。種皮寝具アッセイのアセンブリ（SCBA）

種皮と胚の数を適切に選択するための説明を参照してください。

1. 発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。媒体の表面の上に置いて、ナイロンメッシュの無菌矩形 ​​片（3.5センチ×5.0センチメートル）（ 図2、ステップ1）。
2. 損傷を避けるために、胚および種皮を穏やかに注射針（ 図2、ステップ2）を用いてそれらを押すことによって、鉗子の金属縁部の表面に移動させることができる。ナイロンメッシュ（ 図2、ステップ3）に移植胚と種皮。
3. シードコートは、可能な限り接近されます（ 図2、ステップ4）であることを確認して平滑化鉗子や針を用いて種皮の円形単層を組み立てます。可能な限り公開しようとすることで生成された種皮口上向きに針。このステップは、体系的にテストされていません。胚の増殖を阻害する拡散性物質が直接離れてから胚向かって拡散するよりもむしろことが予想されるので、それはSCBAの効率を高めることができる。
4. ステップ4.3で組み立て種皮ベッド（ 図2、ステップ5）の中央に円形の単一層として胚を置きます。胚は可能な限り接近していることを確認してください。
5. 20〜21℃での連続光（40μモル/ m ^2の S EC）の下でSCBAsインキュベートFRパルスは、発芽を逮捕、通常の光の下でSCBAを組み立て、説明したように、FRパルス^9を適用し、暗闇の中でシャーレを残すために使用されている場合には。

結果

以前の研究は、GAを合成できない変異体の種子は、種子^11,12の高いABAの蓄積の結果として、発芽することができなかったことを示した。その除去は、胚の成長^13をトリガするので、発芽することができないことは、種皮が必要です。このことは、GAを合成することができない種子の胚乳は、胚の成長をブロックするためにABAを放出していることを示した。そこで、GAとABAを合成?...

ディスカッション

ここで説明する種皮寝具アッセイ（SCBA）手続きは、原則として、 シロイヌナズナ種子の発芽がブロック（または遅延）と胚乳がこの逮捕を実装するために疑われているどのような状況にも適用可能である。後者は、種皮（種皮や胚乳）を除去し、胚は種皮に囲まれているときと比較してより高速な胚成長が進行が認められていることを観察することによって証明することができます?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA