根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズム<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;根粒共生と<em&gt;シノリゾビウム根粒</em

要約

標準的な実験プレートから作られた個々の滅菌マイクロコズムにおける窒素固定細菌シノリゾビウム根粒との共生におけるウマゴヤシtruncatulaの植物の成長は、無菌性を損なうことなく、根系や結節の頻繁な検査を可能にします。植物は、最大9週間、これらの成長チャンバー内に維持することができる。

要約

根粒菌は、互換性のあるホストマメ科植物の根に共生窒素固定根粒を形成している。これらの相互作用を研究するための最もよく発達したモデル系の一つは、 ウマゴヤシの履歴書をtruncatula植物です。 Jemalong A17と根粒細菌シノリゾビウムは 1021 メリロティ 。植物の根と共生の表現型のスコアリングを繰り返しイメージングは​​、植物や細菌のいずれかに非破壊的な方法を必要とします。いくつかの植物や細菌の突然変異体の共生表現型は、成長の比較的短い期間の後に明らかになると、ホスト/共生相互作用の長期観測を必要としません。彼らが得点する前にしかし、根粒形成過程の初期段階で明らかにならないの共生効率と結節老化の表現型の微妙な違いは、比較的長い成長期間が必要。いくつかの方法がこのホスト/共生対の長期成長および観察のために開発されている。しかしながら、これらの方法の多くは、他の微生物による汚染の可能性を増大させる繰り返し散水を必要とする。他の方法は、植物の多数の成長のために比較的大きなスペースを必要とする。ここで説明する方法、Mの共生成長truncatula / S滅菌された単一の植物マイクロコズムにおける根粒は 、いくつかの利点があります。これらのマイクロコズム中の植物はその水やりは水やりの際に交差汚染を防ぐ、最大9週間のために必要されていないことを確認するのに十分な水分と栄養を持っている。これは表現型は、結節の開発と早期結節老化の微妙な遅延などの短期的な成長システムに見逃される可能性のある定量化することができます。必要とされていないアップ発根観察のための植物のようにも、小宇宙をルーツと結節が容易に、プレートのふたを通して見ている。

概要

マメ科宿主植物ウマゴヤシtruncatula A17とシノリゾビウムは 1021 メリロティ根粒細菌との相互作用は、根粒の発達と窒素固定共生の研究のための最も扱いやすいモデル系の一つである。両方の共生パートナーのゲノムは^、1,2を配列決定されており、プラントおよび細菌の両方が遺伝子操作^3,4に適している。植物および細菌の変異株の両方の表現型の解析は、根粒の発達の段階を観察し、時間の経過とともに共生の生産性を定量化する能力を必要とします。ここでは、M.の根粒の発達を観察するための方法を記載履歴書をtruncatula。 S.を接種Jemalong A17標準、ラウンド直径100mm、15ミリメートル、深実験室プレート（ 図1A）から作られた個々の小宇宙内メリロティ 1021。シュートは、プレートの側面にある切り欠きのポータル（Figurを介して公開し、成長しているエス1B、1C、および1E）。根は小宇宙の中に含まれているとプレート（ 図1D）の蓋による観察を可能にしながら、無菌保持されます。シュートがアクセス可能であるので、その成長が制約されるものではなく、ルートの無菌性を損なうことなく、定期的に測定することができる。ノッチプレートマイクロコズムを作成する方法は、もともとアルファルファ植物を成長させるためのリーら ⁵によって開発されたが、それは広く、他の方法に比べて多くの利点にもかかわらず、採用されなかった。この方法のバリエーションは、植物の根と菌根⁶の間の相互作用を分析するために開発された。我々は今、Mの増殖に適合し、この方法を最適化していますtruncatula工場 。より一般的に使用される方法に勝るこのプロトコルの利点は、以下に説明する。

Mの根粒形成の研究のために現在広く用いられているいくつかの方法があります。 truncatula inocuSでlated メリロティ ^7。節のある根の大規模調製のために最も一般的に使用される方法は、aeroponicケーソン⁷の成長である。この方法では、植物は、大血管上に懸架され、根はS.の混合物で通気されている根粒と栄養溶液^7。この方法は現実的であるかのSの唯一の遺伝子型根粒は、テストされる。それは細菌の高濃度のエアロゾル化を必要とするため、異なる細菌株を接種したケーソンの間の交差汚染の可能性が高い。多くの場合、接種した植物を大量に調製するために使用される別の方法は、浴槽またはパーライト、バーミキュライト、砂または栄養溶液を注入し、S.を接種された焼成粘土の鉢で成長であるメリロティ ^7。このメソッドは、開いている桶やポットの使用を必要とし、栄養溶液の水やりや補充が必要です。ポットの別の欠点は、植物のことである根や結節の検査のために、この粒子状マトリックスから削除する必要があります。この方法の別の欠点は、ときに、多くの異なるS.インキュベーター空間の大きな領域が必要とされることである別個の鍋は、各細菌の遺伝子型のために使用しなければならないので、 メリロティ遺伝子型は、比較される。 「レナードジャー」は、この方法で^8,9のバリエーションです。レナードジャーは、他の上に1を積層して芯で接続された2つの滅菌の容器で構成されている。増殖培地を下部容器に入れ、パーライト、バーミキュライト、砂、上部容器中の焼成粘土の成長マトリックス中に毛管作用によって芯を通って引き込まれる。苗（単数または複数）は、成長マトリックス中に入れ、S.を接種するメリロティ 。この方法は、水やりは必要ありませんが、根や結節の検査では、苗が粒子状の成長マトリックスから削除されている必要があります。

カンガルーの簡単な検査を可能にするか、いくつかの方法がありますTS。これらの一つは、透明なプラスチックの「成長パウチ^」7である。この方法の欠点は、≤10ミリリットルの液体媒体はM.を成長させるために最適であるので、頻繁な散水が必要とされることである小袋⁷ truncatula。ポーチ実験はまた、通常のため、ポーチ内の紙芯の内訳を、〜2週間⁷に限定されている。一般的に使用される2つの他の方法は、植物を寒天上で増殖させ、根が見えるされていることに我々の手法と同様であるが、これらの方法はまた、我々の手順が回避される欠点を有する。これらの方法では、植物は完全に24.5センチメートル多孔サージカルテープでトップの周りに密封された、または綿のプラグまたはプラスチック製のキャップ⁷で栓を寒天スラント試験管で栽培X 24.5センチメートル寒天プレート内に含まれています。これらの方法はいずれも、根の容易な検査を可能にし、無菌に保つことができる。しかし、寒天斜面管は通常、媒体⁷寒天のみ20ミリリットルで増殖させ、水やりと栄養A必要植物の長期的な成長のためにddition。 24.5センチメートルX 24.5センチメートル内寒天平板マイクロコズムを成長した植物は、長期的な成長のために十分な水分と栄養を持っていますが、根粒^7を阻害する構築することができ、成長のシュートを速やかに囲まれたプレート縮図とエチレンガス内に拘束になる。ここで説明する手順では、シュートを露出させ、長期的な成長を可能にするメディアの〜70ミリリットルが含まれている小宇宙の外に自由に成長する。

ここで説明する手順は、マメ科植物の根粒形成の研究のためだけでなく、他の中型植物の根の表現型の研究のためだけでなく、有用であり得る。これらの小宇宙と伝統的なポリカーボネートの植物組織培養瓶の違いは、ここで説明するプレートマイクロコズムにおける根がダウンジャーの底に寒天の水平層に寒天の垂直面上に成長ではなく、ということです。これは、ルートは、最小のdの寒天表面から持ち上げられることを可能にする根毛や顕微鏡によって根毛の検査を容易に根表面に寒天の最小付着amage。

プロトコル

ステップを実行することは、1、2、4、および無菌層流フード6が推奨される。

1。 Mの準備truncatula A17苗

注：M. truncatulaこれらの研究で使用A17種子は約22℃で、または〜150〜400ミリモル/ mは22〜26℃に維持し、植物生育室で冷却し、温室条件下で生産され^-2 s ^-1の光。

1. 種子の発芽プレートを注ぐ：100ミリメートルの正方形プレート（深い15ミリメートル）を使用し、3〜5 mmの深さまで¹⁰寒天を精製w / vのオートクレーブ処理1.1から1.2パーセントを注ぐ。各プレートは（63から125個/プレートに相当）の種子〜0.25〜0.5グラムを発芽するために使用されます。
   注：このプロトコルで説明されているすべてのプレートのための植物細胞培養テスト済み、精製された寒天を使用することが重要です。寒天のベンダーとカタログ番号の情報は、特定の試薬および装置の表に記載されています。
2. 表面を傷つける/ Mを殺菌truncatula A17シードS：苗、所望の数のための十分な種子を計量する。 （;これは〜63から125の種である0.25〜0.5グラムシード/フラスコ）ピペット濃厚の20ミリリットル（96％）、滅菌ホイルカバー付きの滅菌125ミリリットルのフラスコに種を置きます（M.は A17種子が〜4mgのそれぞれtruncatula） H ₂ SO ₄をフラスコの側面に沿っ。
   注意：酸乱切種子を殺菌します。また、フラスコの側面に沿っ酸ピペッティングすることによって、それが未滅菌種子に接触したフラスコ内に再滅菌するであろう。
3. 滅菌ガラスピペットを用いて種子の塊を壊す。 10月12日分頻繁に各フラスコを旋回。小さな茶色のピットが、種子に見えるようになります。これらは、種皮¹¹の小さな穴である。
   注意：濃H ₂ SO ₄を操作する場合、目の保護と手袋を着用してください。
4. _4の H ₂ SO _を削除し、種子をすすぐ：種子の少なくとも10％は、小さな茶色のピットを持っているか、12分が経過すると、どちらか最初に来る、滅菌ガラスピペットを用いてフラスコからすべての酸を除去する。 （少なくとも300ミリリットルの水道水を入れた1〜2リットルのビーカーに置き、廃酸が、これは、酸を希釈し、過熱を防ぐことができますが。）をフラスコの曲線の残りの酸を収集し、小さなガラスピペットを使用するために、フラスコを傾けて残りのすべての酸を除去。残留酸が残っている場合、それは、すすぎ水と反応し、種子を加熱して、それらを殺します。
   1. すぐに各フラスコに滅菌超純水100mlを注ぐことによって、種子を洗浄します。水の過剰量は、酸を希釈し、水と酸との反応の間に過熱し、種子の損傷を防ぐことができます。水を捨て、フラスコのリップを火炎滅菌する。
   2. 滅菌超純水50mlでシード8-10Xを洗浄します。各すすぎ中にフラスコを旋回。フラスコは、この時点で無菌考慮されるべきで、フラスコのリップは、各すすぎの前に燃え上がっする必要があります。
5. 種子は一晩を吸収しましょう​​：アフター最後のすすぎは、暗い一晩中4℃で各フラスコや場所に無菌ホイルカバーを交換して、各フラスコに50ミリリットル滅菌超純水を注ぐ。
6. 発芽プレートの上に置いて、種子：せる種子は一晩吸収した後、種子を再懸濁してから1.1から1.2パーセント寒天発芽プレート上にそれらを注ぐために20ミリリットル滅菌超純水、渦を追加し、約25mL超純水で2回すすぎ、水を注ぐステップ1.1。種子はフラスコ内に残っ​​ている場合は、より多くの水を追加してから注ぐ。 1プレート（63から125個/プレート）に各フラスコからの種子を配布します。
   1. 種を配布するために、プレートを旋回。種子は、プレートの一端で4〜5センチメートル帯域に均等に分布されるべきである。これは、プレートの「トップ」になります。 「底」5〜6センチメートルは種子（ 図2A）の自由に保つ必要があります。
   2. 滅菌ピペットで水を引く。プレートの底に残った水の流出をさせるために45°の角度でプレートを傾けます。ゴマに蓋を交換してくださいテッドプレート、光から保護します。プレートを10〜20分を排出するために許可する必要があります。 （ 図2B）。
7. 発芽を設定します。滅菌ピペット傾斜プレートの底に溜まった水をすべて削除します。
   1. 蓋を交換し、パラフィルムでプレートをシール。手袋を着用した（ 図2C）無菌に保つ。
   2. 発芽プレートを積み重ねた後、90°の角度でそれらのすべてを上げる。種子は寒天の垂直面に横たわっていることでしょう。完全に吸水種子を簡単に寒天を遵守する必要があります。根は下向き（ 図2D）が成長します。
   3. 光を遮断し、3日間、25℃で維持するためにホイルで発芽プレートのスタックを包む。

注：以下で3日間発芽が進行する場合には、根は小宇宙で寒天に届かない場合があります。発芽は4日以上縮図プレートに移す前に進んだ場合、苗の生存率は意志悪くなる。 M.場合低速の発芽率とのtruncatulaの生態型または変異体が比較されるべきであり、徐々に発芽生態型は、3日以上発芽させなければならない。

2。個々のプレートマイクロコズムの作製

1. Jensenの媒体^12を準備します（組成については表1を参照）、各小宇宙のための約70 mlの培地を許可する。急速に注ぐ（投手はなし以上1〜2以上のL）に便利な投手またはフラスコに準備し、オートクレーブ中に投手の磁気攪拌棒を残す。
   1. 媒体が約55〜65℃、サプリメントが追加されているために冷却され、pHが（表1を参照）をチェックした後、丸直径100mmに15ミリメートルの深いプレートを注ぐ。プレートは、（〜70ミリリットル/プレート）〜0.9〜1センチメートル深い注ぐべきである。
   2. Jensenの培地の成分は、曇った沈殿物を形成することができるので、沈降からコンポーネントを防止するために、定期的に磁気撹拌板に投手を返すことが重要です。析出物はVISかもしれ彼らが固化した後にプレートにible、そして限りが均等にプレートに分散しているように、パフォーマンスには影響しません。
   3. プレートの蓋に結露防止のために注ぐ時にプレートを積み重ねる。
2. Jensenのプレートが固化した後、U字型^5（ 図3A）に屈曲された計量スパチュラで両プレートと蓋ノッチ。レッドホット、ノッチ5-6枚までバーナーでヘラの曲がりを加熱してから、再度加熱する。ノッチ付き蓋がノッチプレート上に置かれたとき、これは、苗の茎（ 図3B）を介して成長される楕円形のポータルを作成する。ノッチプレートを格納する場合には、パラフィンフィルムで個別に包む..

3。 シノリゾビウム根粒文化の調製

二日植物接種前に、全てのSの文化を開始根粒は、苗に接種することが株。 Cultu2.5のMgSO _4、2.5mMのCaCl _2、および適切な抗生物質（TY培地でもうまく機能）を補充した解像度LBMC（ルリア-ベルターニ[ミラー]）中で増殖されるべき媒体^13。各培養物のわずか2〜3ミリリットルで十分です。

1. 細胞が密になるまで2日間、振とうしながら30℃で成長する。
2. ほとんどの植物接種のために、Sの成長期根粒は重要ではない。一般的に、後期対数または初期定常期の細胞が用いられる。

4。 Mをレイアウトする個々のマイクロコズムにtruncatula苗

1. 3日後、（ステップ1で調製）発芽プレートを開いて、すぐに滅菌超純水をフラッディングする。ディップは、エタノールと殺菌する炎を簡単に鉗子。やさしく乾燥を防ぐために水の下で、すべての苗の根の先端をプッシュする滅菌ピンセットを使用しています。根は2〜6センチメートル長距離ます。大半3-4 cmになります。ストレートルーツと明らかなと苗を選択欠陥。
2. 結露の蓄積のためにJensenのメディア小宇宙のふたを確認してください。結露を削除するか、新しいノッチ蓋と交換する蓋をフリック。蓋に結露が過剰がある場合は、苗の根は、蓋に付着して、結露が乾燥した後に死亡することがあります。
3. 鉗子を使用して、ゆっくりと子葉で発芽プレートから苗を選んで、Jensenのメディア小宇宙に根を置く。根端寒天に接触していることを確認します。
4. それがまだ存在する場合はそっと種皮を取り除きます。種皮には5〜10分間水に浸した後に緩んでなければなりません。静かにそれは方法を提供しますまで、ピンセットで種皮をいじめるし、捨てる。撮影の子葉と約0.5cmのプレート（ 図4A）で、Uノッチから突出しなければならない。丁寧に苗（ 図4B）のためのポータルを作成すること、苗の上に蓋のUノッチプレートの蓋を交換してください。すべての苗が小宇宙上に置かされるまで、水平スタックに置いプレートを設定します。
5. 実行可​​能な見て、まっすぐに根を持っているそれぞれの発芽プレートから全ての苗を使用してください。 （可能な場合は、単に接種前しおれた苗の代替品として使用するように未開封の苗の1のプレートにしておきます。）
6. すべての苗をレイアウトした後、それらを水平Jensenの小宇宙に座ることを可能にしているが、S.根粒接種懸濁液は、準備されている。

5。 Sの準備根粒接種懸濁液

1. Sをチェックする定期的に接種後根粒培養は、彼らが成長していることを確認します。 2日間増殖させた後、OD _600は 2と4の間であるべきである。
2. ピペット滅菌した1.5​​mlチューブ、ペレットを遠心分離機に各文化の0.5ミリリットル。上清を取り除きます。
3. 0.85％無菌NaClまたは滅菌超純水のいずれかで細胞を2回洗浄します。 0.5ミリリットル0.85％ステレオで細胞を再懸濁NaClまたは超純水をニトリル。
4. 再懸 ​​濁S.の1/10希釈液のOD _600を測定するステップ5.3からメリロティ文化。この読み取りに基づいて、OD ₆₀₀ = 0.05に滅菌超純水で各培養物の懸濁液とし。細胞密度が高すぎると、根粒形成を抑制することができる。 100μlを各苗に接種することができるように、希釈懸濁液を十分に確認してください。 OD ₆₀₀ = 0.05懸濁液の濁りは、目でわずかかろうじて認知すべきである。

6。マイクロコズムの接種とシール

1. 直前に始まる接種に、Jensenのメディア小宇宙への転送を生き延びていないしおれた苗をチェック。発芽プレートからの新鮮な苗とのそれらの苗木を交換してください。
2. 各小宇宙を開き、適切なS.100μlの接種苗の根の上にメリロティサスペンション。蓋を交換し、水平STACに取っておく6月10日小宇宙のKS。各S.のためのメリロティ株は、比較される、少なくとも15の植物に接種。共生生産性の微妙な違いを持っ​​ている株について、30〜35の植物に接種。ネガティブコントロールとして未接種の少なくとも10の植物を残す。 Sで30〜35の植物に接種メリロティ 1021または他の適切な野生型株を陽性対照として機能する。
3. 後にS.メリロティサスペンションは根表面に吸着するための時間を持っていたし、懸濁液を寒天（少なくとも20分）に浸漬している、パラフィンフィルムで個別に各プレートをラップします。プレートは、ノッチの非常にエッジに包まれるべきであるが、パラフィンフィルムは苗（ 図4C）の成長を阻止するべきではありません。
4. ラッピングの際には、プレートの蓋の内側に付着した根のための最終的なチェックを行う。蓋から付着した根を取り除くベンチに平板を置き、寒天SUに戻しダウンルートをノックするように蓋をタップまたはフリックするにデータポート。
5. 6月10日版の各スタックの苗ポータルをラインアップ。上向きの苗（ 図4D）と90°の角度でスタックを置く。パラフィンフィルムの粘着1-2センチのストリップを残して、ホイルでスタック全体を包むように十分な長さの所定の位置にプレートを保持する苗は（ 図4E）出現場所アンラップ。ホイルは光から根を保護します。
6. （16時間明/ 8時間暗のサイクルで21〜25℃、60〜70％の相対湿度および100から175マイクロモル/ M ^-2 S ^-1光で照らさ成長チャンバーまたは成長ルームでホイル包まスタックを配置図1A）。これらの成長条件の下で、光レベルでの長時間のインキュベーションは、より高い200μモル/メートル^-2 s ^-1の植物成長に有害な影響を有することができる。

7。根系と共生の表現型の定量の検討

植物は、維持することができる最大9週間の小宇宙。

1. 結節数は、各スタックからホイルをアンラップし、結節を計数することにより一連の時間点で定量することができる。 S.を接種した植物に根粒を開発メリロティ 1021野生型接種後10〜14日で明らかである。
2. 共生生産性も新興シュートの長さを測定することにより、各時点で測定することができる。
3. 共生の生産の最終定量は、通常撮影を取り外し、撮影の生重量を測定することにより、接種後7週目に行われている。長い成長が必要な場合は、このステップは、後半9週ようにして行うことができる。

結果

これらのプレートマイクロコズムの調製及び接種は、冒頭で説明した大部分の他の方法に比べて比較的単純である。これらの小宇宙の使用も水やりや栄養素の補給、ルート無菌性の維持、両方のルーツと光から根の保護を容易に検討することなく、（9週まで）延長された植物の成長を可能にし、植物の制約のない成長は、のために撮影して、簡単にアクセスを撃つ長さ測定、及び根毛への最...

ディスカッション

成功のために不可欠なプロトコルのいくつかのステップがあります：1）精製された、植物細胞培養を使用する必要は寒天を強調しすぎることはできませんテストされています。これはアルファルファの苗のために重要ではないが、それはMの成長のために重要であるtruncatula A17。 2）ステップ1に記載したように垂直寒天プレート上に実生を発芽することが重要である。苗の根がま...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921