光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

要約

ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。

要約

一緒に光音響熱量測定および熱格子と光熱ビーム偏向は、伝統的なストップを使用してアクセスできない時間スケールをミリ秒、マイクロ秒でのタンパク質の立体構造変化を誘起光の時間プロファイルボリュームとエンタルピー変化を監視する光熱方法のファミリーに属するフローの楽器。さらに、体積および/またはエンタルピーの全体的な変化がプローブされているので、これらの技術は、タンパク質およびフルオロフォアおよび発色団又はラベルを欠く他の生体高分子に適用することができる。カルシウムトランスデューサ、このような神経細胞のカルシウムセンサー、ケージカルシウム化合物、DM-nitrophenへの結合のCa ^{2 +}に関連した構造変化のダイナミクスとエネルギー論を監視するには、フォトトリガーに遊離カルシウムの急速な（τ<20秒）増加して採用されている濃度及び関連するボリュームとエンタルピー変化は、光熱ビーム偏向技術を用いてプローブする。

概要

このような光音響熱量測定、光熱ビーム偏向（PDB）、およびナノ秒レーザー励起で結合された過渡回折格子などの光熱方法は、短寿命中間体^1,2の時間分解研究のための過渡光分光法への強力な代替物である。そのような過渡吸収及びIR分光法などの光学技術とは対照的に、それは周囲の発色団の吸収変化の時間プロファイルを監視、光熱技術は、熱/体積変化の時間依存性を検出し、したがって、光学の時間プロファイルを調べるための貴重なツールである「サイレント」のプロセス。これまでのところ、光音響熱量測定および過渡回折格子が正常グロビン^3,4、酸素センサータンパク質とリガンドの相互作用における二原子リガンドの移行を含む光誘起プロセスのコンホメーションのダイナミクスを研究するために適用されているFixL ^5、6オキシダーゼ電子とヘム-銅におけるプロトン輸送AND光化学系IIだけでなく、ロドプシン⁷とクリプトクロム⁸の立体構造力学の光異性化。

内部発色団および/またはフルオロフォアを欠いている生物学的システムへの光熱技術の適用を拡大するため、PBD技術は依存して、光トリガにケージド化合物を用い、数マイクロ秒以内に、リガンド/基質濃度の増加またはより速いと組み合わせたケージド化合物に関する。このアプローチは、ダイナミクスと内部フルオロフォアまたは発色団を欠いていると商業ストップフロー機器からはアクセスできませんタイムスケール上にあるタンパク質に結合するリガンド/基質に関連する構造変化のエネルギー論のモニタリングを可能にする。ここではダウンニューロンのカルシウムセンサーのC末端ドメインにケージ化合物の熱力学を監視するためのPBDのアプリケーション、Ca ^{2 +}のDM-nitrophen、光切断だけでなく、Ca ^{2 +}の関連についての動態ストリーム調節エレメント拮抗モジュレータ（DREAM）が提示されている。 Ca ^{2 +を、}光にリリース〜300秒の時定数でunphotolysedケージにCa ^{2 +を} 10秒と再バインド内のDM-nitrophenからのものである。一方、apoDREAMの存在下で、ミリ秒の時間スケールで発生する追加の運動を観察し、タンパク質へのリガンド結合を反映している。生物系の高次構造遷移をプローブするPBDの適用は、何らかの形で楽器の難しさのために制限されている、強力かつ再現性のPBD信号を達成するためのプローブとポンプ光の例えば骨の折れる整列。しかし、計測機器のセットアップの綿密な設計、温度の正確な制御、およびプローブとポンプ光の慎重な位置合わせは、広範な上、時間分解体積とエンタルピー変化のモニタリングを可能にする一貫性と堅牢PBD信号を提供10秒で約200ミリ秒の時間スケール。また、modificなど 、同一温度、緩衝液組成、光学セルの向き、レーザパワー、下のサンプルとリファレンストレースの検出を確実にする実験手順の管理ポイントを大幅に測定された反応容量およびエンタルピーでの実験誤差を低減します。

プロトコル

1。試料調製

1. サンプル調製、不要なアンケージングを防ぐために、暗室内のすべてのサンプル操作を行ってください。
2. 50 mMのHEPESでN、N、N '、N' -テトラキス[（オキシカルボニル）メチル] -1,2 -エタンジアミン） - （2 -ニトロ-4,5 -ジメトキシフェニル） - DM-nitrophen（（1を可溶化バッファー、100mMのKCl、400μMの最終濃度pHは_{7.0（ε350nmで} = 4330 M ^{-1 cm -1}の^9）。
3. [DM-nitrophen]：の[Ca ^{2 +]}の望ましい比率を達成するために、0.1M原液からのCaCl _2を追加します。 10μMを超えるCa ^{2 +}の関連についてのK _dでタンパク質については、の[Ca ^{2 +]}の比1:1の[DM-nitrophen]はアンケージドDM-nitrophenに写真リリースのCa ^{2 +}の結合を防ぐことが望ましい。実際に、カルシウムの90％がタンパク質に結合〜10 nMおよび400 mMのようにするDM-nitrophenおよびCa ^{2 +}の合計濃度であることがDM-nitrophenためのK _d値を考慮したK _dで=10μMのはapoformになります。一方、K _dは 、<10μMのタンパク質への結合のCa ^{2 +}の研究のためには、の[Ca ^{2 +]}低下することが好ましいのとおりでのCa ^{2 +}の錯体形成を防止するために0.95 [DM-nitrophen]比はアポタンパク質ケージ光解離前。
4. 参照化合物、K ₃ [鉄_{（III）（CN）6]}試料と同じ緩衝液中のNa又は₂のCrO _4を可溶化する。

2。実験のセットアップ

1. 基本的な実験構成を図2に示す。
2. 1mmのプローブビームの直径（He-Neレーザーの632nmの出力を、〜5mWのレーザパワー）を調整し、温度が配置セルの中心を通ってプローブ光を伝播させるピンホール（P _2）を使用M ₁ミラーを使用して制御セルホルダー。
3. プローブビームを中央にサンプルの後ろにミラー（M _2）を使用します位置敏感型検出器の中心に。
4. 検出器の左右側の上部の2つのダイオードと底部つのダイオード間の電圧差ならびに2つのダイオード間の電圧の差があるように検出器の中心にプローブビームを集束ゼロ。
5. 2 355nmのレーザミラーの間に配置され、3mmのピンホール（P _1）を用いてYAGレーザ、FWHM 5ナノ秒）：続いて、ポンプ光、Q-スイッチNdの355nmの出力の直径を形作る。
6. 図2に示されているように、キュベットの中心を通ってポンプビームをCopropagate。これは、両方のレーザビームが測定可能な偏向角を得るために、ほぼ同一直線上に同様に光学セルの中心を通って伝播しPBD信号の振幅、高されていることが重要である。実験条件下で、プローブとポンプビームの交差角が15°未満である。
7. プローブおよびポンプを整列させる参照化合物を使用するより長い時間スケール（〜100ミリ秒）で良好なS / N比や安定したPBD振幅、すなわち 、良好なPBD信号を達成するためにビーム。
8. 355nmのレーザミラーの増分調整することによって、プローブビームに対してポンプビームの位置を調整する。
9. 位置検出器上の2つの頂部と底部のフォトダイオードの間の差としてPBD基準信号の振幅を測定する。 PBD信号は速い時間スケール（<10秒）での振幅の急激な増加を示し、 図3で示したように100ミリ秒の時間スケールで安定して維持する必要があります。 PDB振幅の変動に撮影されたシュートは、信号振幅の5％以内であり、信号の再現性は、主に振動によって影響される。
10. 吸収された励起レーザパワーオン·アインシュタインの数のPBD信号の線形依存性を、E a _を測定することにより放出される熱エネルギーに対してPBD信号振幅の線形性を確認するAは、励起波長での吸光度を基準に相当^{=（1-10-A）。}
11. レーザパワー下記約1,000μJと多光子吸収とそれぞれポンプ光パワーの低下を防止する励起波長が0.5未満での試料/基準化合物の吸光度を維持し、PBD信号の線形性を確保する。

3。 PBD測定

1. 参考のためにPBDトレースの測定を開始します。 1.0センチメートル×1.0センチ1.0センチメートル×0.5センチメートルの石英セルに参照化合物の溶液を配置し、温度制御されたホルダーにセルを配置する。両方の経路長は、同等のPBD振幅を提供する。
2. 3℃の温度増分で16〜35°Cの温度範囲における温度の関数として基準PBD信号を検出
3. 各々の温度変化の際に、位置検出器上のプローブビームの位置を確認し、再必要に応じて、検出器の中心に位置を調整します。
4. 数2に従って、[（DN / DT）/ C _Pは ρ用語の関数としてPBD信号の線形性を確認してください。
5. 基準測定のための光学セルの同じ向きを維持参照化合物と同様の光学セル内の試料溶液を置く。
6. PBDは、基準と同じ温度範囲でトレースし、[（のdn / dt）は/ C _pが ρ用語に対して試料PBD振幅の線形性を確認する試料を検出する。

4。データ解析

偏向の大きさは、 式1に従って試料加熱_{（ΔVth）を}非熱的及び体積変化（ΔVの_nonth）による体積変化に正比例する。

サンプルの振幅_（S）および参照_（r）の PBD信号は、それぞれ式2及び図3を用いて説明することができる。

PBD信号は、計器応答パラメータ（K）に正比例し、アインシュタインの数は、（E _a）に吸収される。 式（2）の最初の項は、（DN / _{DT）（1/ρCp）は} 、Qによる溶剤中に放出された熱への信号変化に対応する。のdn / dtの項は、屈折率の温度依存性の変化を表し、ρは溶媒の密度であり、C _pは熱容量である。すべてのパラメータは、蒸留水で知られており、蒸留水および適切な緩衝液中の参照化合物についてPBD信号を比較することにより、緩衝液について決定することができる。 Qは熱の量であるreturne溶媒D。 ρ（DN / Dρ）項は、10〜40℃の¹⁰の温度範囲で温度に依存しない単位、ほぼ一定である。 Δnは_腹筋用語は、溶液中の吸収種の存在のために屈折率の変化に対応し、プローブビームの波長は、溶液中の任意の種の吸収スペクトルに対してずれている場合、それは無視できる程度だ。参照化合物_（r）とから生じる信号は、E _さhνは光子励起波長におけるエネルギー、E _hは_ν= 355 nmの励起のための80.5キロカロリー/モルである式（3）で表される。

1. 図3に示されているようにプリトリガ及びポストトリガーPBD信号との間の差としてPBD基準信号の振幅を取る。同様に、高速（A _sの ^速い ）の振幅を決定し、遅い相（A _sの ^スロー）サンプルPBD信号の。
2. 計器応答パラメータを排除するために、Kは、参考のためPBD信号の振幅によって試料PBD信号の振幅をスケーリングする。基準信号サンプル信号の比が式（4）を与え、のように書くことができる。
   
   
3. この式を使用して、溶液（Q）に放出された熱および_[（S / _R）Eのプロットのそれぞれ傾きと切片からの光開始反応に伴う非熱体積変化（ΔVの_nonth）を決定温度依存的な[（DN / DT）（1/ρCp）]に対する_Hのν用語。
4. 高速と低速のプロセスのための反応体積とエンタルピー変化を決定するために、 式5-7に応じて適切な量子収率が観察され、ボリュームおよびエンタルピー変化をスケール。
   
   
   
   
   
   
   200ミリ秒〜10秒の間の時間スケールで発生する反応速度を有する多段階プロセスについては、反応の個々のステップに関連するボリュームとエンタルピー変化を決定することができる。個々のステップのための振幅および寿命が体積とエンタルピー変化の時間プロファイルを記述する関数F（t）にデータを当てはめることによって分析される。
   
   α0は、A、S、 高速に対応しており、 私は、A、S、 低速 、個々のプロセスのために対応してα、τ はどこで個々の反応工程の寿命である。 foの速度定数の温度依存性からrは、個々のプロセスは、活性化エンタルピー及びエントロピーパラメータは容易にアイリングプロットを用いて決定することができる（i = 1 から/τiの k個）。

結果

PBDの代表的な例は、Ca ^{2 +} DM-nitrophenからのCa ^{2 +}放出光は、図3に示されているトレース。遅い位相がCA ^{2 +} nonphotolysedケージとの結合を反映しているのに対し、FASTフェーズは、Ca ^{2 +}のDM ^は 、nitrophenおよびCa ^{2 +}の解放の光切断に対応しています。温度依存係数[C _のpρ/（のdn / dt）が〕の関数として基準化合物の大きさにスケーリ...

ディスカッション

光熱方法の背後にある物理的な原理は、光励起分子は周囲の溶剤^1,12の熱加熱で、その結果、基底状態に振動緩和を経由して余分なエネルギーを消費するということです。水などの溶媒の場合、これは急激な体積膨張_{（ΔVth）を}生成する。励起状態の分子はまた、結合開裂/形成および/ ​​または分子の（ファンデ、すなわち変化の分子の大きさを変えることができる分...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300