その場圧縮負荷と骨歯根膜歯繊維状合同の相関的非侵襲的イメージングで

要約

本研究では、繊維性関節生体力学するマイクロX線コンピュータ断層撮影法と結合され、その場ローディング装置においての使用が議論される。実験の関節バイオメカニクスでの全体的な変化との識別可能な読み出しが含まれます：変位対1）反力を、 すなわち歯の歯槽ソケット内の変位と荷重への反動応答、2）3次元（3D）空間配置および形態計測、 すなわち幾何学歯槽ソケット歯の関係、および3）により装填軸の変化に読み出し1,2の変化、 すなわち、同心または偏心荷重。

要約

この研究は、新規バイオメカニクス試験プロトコルを示しています。このプロトコルの利点は、このようにシミュレートされた生理的負荷および湿潤条件下で内部構造要素の可視化を可能にする高分解能X線顕微鏡に結合されたその場でのローディング装置の使用を含む。実験の試料は、無傷の骨 - 歯周靭帯（PDL）歯繊維状の関節が含まれます。変位対1）反力：歯の歯槽ソケット内での変位と荷重に対するその反動的応答、2）三次元（3D）空間配置の結果は、それらは、臓器レベル生体力学に適用することができるように、プロトコルの三つの重要な特徴を示すであろうおよび形態計測：幾何学的な肺胞のソケットと歯の関係に起因すなわち 、同心から偏心荷重に積載軸の変化への読み出し1及び2において3）の変更。提案されたプロトコルの有効性は、機械的なテを結合することによって評価される三次元形態計測と関節の全体的な生体力学に読み出しを刺す。また、この技術は、従来の繊維接合部の断層像を取得する実験条件、具体的に反動的負荷を平衡化する必要性を強調する。これは、提案されたプロトコルは、 エキソビボ条件下での試験片の試験に限定され、軟組織の機械的応答を可視化する造影剤の使用は、組織および器官レベルの生体力学に関する誤った結論を導くことができることに留意すべきである。

概要

いくつかの実験方法は、可動結合の繊維状関節の生体力学を調査するために使用され続けている。歯の器官に特異的な生体力学の方法は、歪みゲージ^1-3、光弾性法^4,5、モアレ干渉法^6,7、電子スペックルパターン干渉^8、およびデジタル画像相関^{（DIC）9-14}の使用を含む。本研究では、革新的なアプローチは、繊維接合部の内部構造（石灰化した組織とそのインタフェース軟らかい区域からなる、このような靭帯などの組織とのインターフェース） インビボ条件に相当する負荷でを露出させるためにX線を用いた非侵襲的イメージングを含む。マイクロX線顕微鏡に結合されたその場での装填装置が使用される。ロード時および荷重 - 変位曲線は、新たに採取したラットヘミ下顎骨内の関心のモルロードされるように収集することができる。 M1）無負荷時にロードされ、2の場合）に同心と偏心してロードされたこの研究で提示アプローチのAINの目標は、3次元での条件を比較することにより、歯の骨の形態の効果を強調することである。カット標本の必要性を排除し、湿潤状態で、全体完全な臓器で実験を行うためには、3D応力状態の最大保存を可能にする。これは様々な荷重シナリオの下での複合体の動的プロセスを理解する上で、調査の新しい領域を開きます。

本研究では、スプラーグドーリーラットの無傷の線維関節内の試験PDLバイオメカニクスのための方法は、最適な生物工学モデル系として考え継手について詳細に説明する。彼らは臓器レベルのバイオメカニクスに関連する実験は、関節の三つの重要な特徴を強調するために、水和された条件の下で咀嚼負荷のシミュレーションが含まれます。 3点が含まれます：変位対1）反力を：歯の歯槽ソケット内の変位と荷重への反動応答、2）3次元（3D）空間構成と形態計測：歯槽ソケット歯の幾何学的関係、および原因の変化に読み出し1及び2において3）の変化すなわち 、同心から偏心荷重に積載軸。提案手法の3つの基本的な読み出しは、機能的需要の変化、および/または疾患に起因するいずれかの脊椎動物における関節の適応性を調査するために適用することができる。前述の読み出しの変化、異なる負荷率で特異的に変位に反動的負荷との間の相関関係、および反動ロード時および荷重 - 変位曲線を生じたが、関節の生体力学の全体的な変化を強調するために適用することができます。提案されたプロトコルの有効性は、三次元形態計測および関節の全体的な生体力学に機械試験読取値を結合することによって評価される。

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プロトコル

動物のハウジングと安楽死：このデモで使用されるすべての動物は動物実験使用委員会（IACUC）と国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに基づいて病原体を含まない条件下で飼育した。

標準ハードペレットラット飼料と水アドリブで動物を提供する。 IACUCによって承認されたUCSFの標準的なプロトコルに従って、二酸化炭素窒息、両側性開胸の二段階法を介して動物を安楽死させる。組織の劣化を避けるために、動物の犠牲の24時間以内の生体力学的試験を行う。

1。ラット下顎または上顎の製造および解剖

1. 筋突起と関節突起プロセス（ 図^1）15を含む全体の下顎を維持しながら、ゆっくりと膜状の組織や筋肉組織の添付ファイルを切断することによって、ラットの下顎骨を削除します。
2. 車で別々のhemimandiblesefullyメスの刃と下顎恥骨の繊維組織を切断する。
   注：これらは、物理的に2 ^番目の臼歯の生体力学的試験を妨害した場合、冠動脈および下顎頭プロセス、および下顎骨の枝（ 図1）を除去しなければならない。
3. モルのロードを妨げないよう髄室を公開することなく切歯を切った。

2。 その場での圧縮荷重用の試料作製（図2）

1. その場でのローディング装置 （ 図2A）でそれをロードする前に、実験試料よりも有意に硬い材料を用いてスチールスタブに試料を固定する。
   注意：ポリメチルメタクリレート（PMMA）があれば、歯科Explorerを使用して除去し、本試験と超過試料を固定するために使用された。
2. 両方でストレートエッジを使用して原子間力顕微鏡の金属試料ディスクと金利のパラレルのモル（S）の咬合面の位置を合わせます平面（ すなわち近心-遠心と頬舌下）。
3. 臼歯の周囲の鈍器とトラフを作成します。
   注：この空間は、余分な液体が含まれており、 その場での負荷の間に組織の水和を維持するための「堀」として機能する必要があります。
4. 歯科用コンポジットを使用した同心円状（ 図2B）または偏心（ 図2C）ロードに構築するために、歯の表面を準備します。 15秒間咬合面上の35％リン酸ゲルで目的の歯の表面をエッチングする。
5. 脱イオン水で十分にエッチング液をすすぎ、空気/水シリンジまたは圧縮空気ボンベを使用して表面を乾燥させる。エクスプローラで、薄い層で、オープンカスプに接着剤の滴を広げた。歯科用硬化光で複合を治す。
   注意：コンポジットを含むすべてのステップは、ランプからの直接光せずに実行する必要があります。このような条件は、望ましくない重合プロセスを加速し、クーロンう複合体の適切な配置を妨げるdは。部屋の照明が許容される。
6. 細かいメスまたはカミソリの刃で隣接する歯から余分な接着剤を除去します。
7. 表面の調製後面には、流動性歯科用コンポジットを配置して、歯科Explorerを使用して、関心のモル（S）の溝にそれを広げた。
8. 30秒間、歯科用硬化光にコンポジットを公開します。
9. 関心のモル（S）と30秒間光硬化の咬合面から、歯科用レジンコンポジットを使用して約3〜4程度の咬合の蓄積を成形。
10. ストレートエッジと高速ハンドピースを使用して、すべての試料間で整合性のある負荷スキームを有効にするには、平らな面に平行に、複合の蓄積の上を減らします。
    注：生体力学テスト中に、他の標本は、50 mg / mlのペニシリンをトリスリン酸緩衝液（TBS）に格納され、ストレプトマイシン¹⁵すべきである。

3。ローディング装置ドリフトと剛性、材料特性差別化機能、繊維状合同の現場読み込み中

1. 図2（b）に示すように均一なロード用のロードステージのアンビル上の複合蓄積した試料、およびテストを固定します。
2. （ 図2Bおよび2C）、同心または偏心荷重をチェックするために、有限の負荷に試料をロードすることによって、その後、複合材料の表面に咬合紙を置きます。
3. 試料水和を確実にするために、検体を中心に、TBSに浸したキムワイプを配置します。標本の周りトラフを行い、撮像中に水和さの臓器を維持するためにTBSでそれを埋める。
4. hemimandibleの固定化以下の変位速度で所望のピーク負荷にモルを圧縮するDebenソフトウェアに入力ピーク荷重と変位速度。
   注：材料は荷重変換器の感度= 0.1（時間をかけて圧縮される典型的な読み出しは反動負荷を含める必要がありますN）。ロード時や変位時から、圧縮された材料のための荷重-変位曲線は^16〜18を取得する必要があります。荷重サイクルから収集されたデータを用いて、関節の諸特性を決定することもできる。関節の剛性は、変位曲線¹⁹対 ​​荷重の負荷フェーズの直線部分（データの最後の約30％）の勾配を取ることによって計算されるべきである。

4。リンタングステン酸（PTA）と軟組織染色、PDL、

注：X線減衰のコントラストを高めるために、PDLは、5％のPTA溶液²⁰で染色されるべきである。

1. きれいな1.8ミリリットルガラスカープルに埋め戻し、PTA染色液と注射器に充填カープルを置く。
2. 関心対象の分子の周囲の歯周組織に構造上の損傷を防止するために隣接する歯のPDL空間内に溶液をゆっくりと（5分/カープル）を注入する。
   （注）上記の手順をbすべき溶液の約5浴室carpules（9 ml）を注入し、周囲の組織に流すされるまで電子を繰り返す。準備された標本はまた、残りのPTA溶液（8時間）中で一晩浸漬することができる。

5。推奨されるμ-XCTスキャン設定

次のスキャン設定でM-XCTを実行します。

対物倍率	4X、10X
	1800の画像
X線管電圧	75のkVp（PTA染色したサンプルでは50のkVp）
	8 W
露光時間	〜8月25日秒*
	〜4μmの（4倍対物レンズ）、〜2ミクロン（10×対物レンズ）**

*露光時間は、幾何学的形状と、試料とX線管のvoの光学密度に基づいて変化し得る間電圧。
**実際のピクセル解像度が若干源、試料、検出器の構成に基づいて異なるであろう。

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結果

定荷重下でのローディング装置「バックラッシュ」、「プッシュ」、剛性、およびシステムのドリフトの推定

バックラッシュ：サイクルのロードとアンロード部の間に、真のアンロード標本が離れてトップジョー（ 図3）から引っ張るすなわちとして、開始前にモーター内で逆ギヤその間3秒のポーズが存在する。この期間は...

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ディスカッション

このプロトコルを確立する最初のステップは、剛体を用いて装填フレームの剛性の評価に関連している。結果に基づいて、剛性が著しく低い剛性値を有する標本のさらなる試験のためのローディング装置の使用を可能に有意に高かった。第二段階は、剛体、異なる架橋密度のPDMS材料、及び繊維状ジョイントを用いて生成された搬入出曲線の2つの相を用いることにより、異なる剛性値を区別?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker Blade	BD	MEDC-001054
AFM metal disk	Ted Pella	16218
Polymethyl methacrylate	GC America	N/A
Uni-Etch	Bisco	E5502EBM
Optibond Solo Plus	Kerr Corp	N/A
Filtek Flow	3M	N/A
Hurculite Ultra	Kerr	34346
Tris buffer	Mediatech Inc.	N/A
Articulating paper	Parkell Inc.
Phosphotungstic Acid	Sigma Aldrich	HT152