慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

要約

神経幹/前駆細胞（NPCの）の移植は、再生神経学に大きな約束を保持している。のNPCの全身送達は、脳および中枢神経系の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に幹細胞を提供するために効果的な、侵襲的な低、かつ治療に非常に効果的なプロトコルになっています。

要約

神経幹/前駆細胞（NPCの）は、再生神経の脳の修復や復元を目的とした移植のアプローチのための有望な幹細胞源である。このディレクティブは、脳の修復が神経疾患のいくつかの前臨床モデルでの焦点または全身NPC移植後に達成されていることを豊富な証拠から生じている。

これらの実験データは、緊急の評価を必要とする脳疾患のための修復、幹細胞治療の主なハードルの一つとして細胞送達経路を同定した。実質内の幹細胞移植は、例えば、脊髄損傷およびパーキンソン病のような単離され、アクセス可能な脳の病変によって特徴付けられる病状の論理的なアプローチを表す。残念ながら、この原理は、多発性硬化症（MS）を含む、不十分、多焦点を特徴とする状態に適用炎症性および散在性（時間的にも空間の）性質である。このように、脳はシステム経験による標的EMIC NPC送達は、脳および中枢神経系（CNS）の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に細胞を送達するための低侵襲性治療上有効なプロトコルとなっている。

細胞送達のこの代替方法は、（i）に特異的にそれらの生得的な能力、NPCのpathotropismに依存している機能的な細胞接着分子および炎症性サイトカインおよびケモカイン受容体を介して環境を感知し; （II）静脈後漏れるの解剖学的障壁交差または脳室内（ICV）注射（ 静脈 ）; （iii）の炎症性の脳および脊髄損傷の複数の血管周囲部位（単数または複数）のレベルで蓄積する。および（iv）インビボで異なる宿主標的細胞上に顕著な組織栄養および免疫調節効果を発揮する。

ここでは、我々はIVのために開発した方法が記載されている。と<EM慢性CNS炎症性脱髄のモデルとして実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスにおける同系のNPC> ICV配信、および再生神経学における炎症を起こした脳の選択的標的化のための貴重な技術のような全身性幹細胞送達を想定。

概要

強力な証拠は、CNS障害^1-8の動物モデルにおける体性神経幹/前駆細胞（NPCの）移植の治療効果を証明するインビボ研究から生じた。これらの実験結果は臨床応用に変換することができる前に、それにもかかわらず、宿主への幹細胞の送達に関連する問題の数は、慎重な検討が必要です。多病巣性、慢性炎症性脳疾患のための（非造血系）回復幹細胞治療の開発に向け、特に、実質的なハードルは、NPCの注射の理想的なルートの同定である。対象となる疾患の病態生理をしっかり理解（限局性または多病巣性、原発性または原発性変性）、および配信技術に関連する実現可能性とリスクの問題の慎重な分析は、幹細胞送達に最適なプロトコルを識別している。

（焦点間例えば。神経系の実質に）幹細胞移植損傷の空間的に閉じ込められた領域によって特徴付けられるCNS疾患の治療への論理的アプローチである（ 例えば、パーキンソン病およびハンチントン病、脳および脊髄外傷、および脳卒中）、非常に同じアプローチを証明することができるこのような多病巣性、慢性、および空間的に播種性CNS損傷が時間をかけて蓄積し、MS、などの条件に実質的に実行不可能であると。この後者の場合、個々の病変に焦点細胞注入を標的はまた、このように低侵襲NPCの移植に標的CNSの他の、より適切な方法の識別を促す、CNS実質内長距離にわたって移行する移植されたNPCの限られた能力によって妨げられる。

大きな期待はCNS9外に血管内に注入された場合のNPCは、マウスにおける頭蓋内腫瘍（ 例えば神経膠腫）を標的観測から明らかになった。この独創的な次の幹細胞pathotrophism ¹⁰のin vivoでの証拠に 、広範なデータは、静脈内のいずれかを介して 、炎症性CNS損傷のモデルとして、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）と実験動物における実現可能性とのNPCの全身移植の治療効果に関する蓄積されてきた（IV）または脳室内（ICV）のNPC注入^{1,2,5,6,8···}私たちは、まず、これはターゲットと入力し、炎症を起こしたCNSに、その後、複数の細胞間に係合するように移植したNPCの能力に依存していることが示されている生体 ¹¹ 内の特定の微小環境内で通信プログラム。特に中枢神経系を標的とするために、NPCは脳脊髄液（CSF）ICV注射による循環、または静脈内注射を介して血流への直接配信されます。一度血流またはCSFのいずれかを入力し、移植されたNPCは積極的に相互作用血液脳（BBB）または血液脳脊髄液（BCSFB）障壁とCNS実質を入力してください。 NPCグラフト及びBBB（又はBCSFB）との間のこの相互作用は、NPC表面の細胞接着分子（CAM）の特定のセットにより調節および活性化内皮/上衣細胞^12-14上のCAMカウンターリガンドの高レベルの発現によって促進される。これらのCAMの例としては、ヒアルロン酸の受容体であるCD44、および細胞間接着分子（ICAM）-1のリガンドは非常に遅い抗原（VLA）-4 ^5,15,16（つまり、白血球では、活性化上衣との相互作用の責任があるが含まれおよび内皮細胞）、およびはるかに低い程度のリンパ球機能関連抗原（LFA）-1およびP-セレクチン糖タンパク質リガンド（PSGL）-1。 NPCはまた、CCR1、CCR2、CCR5、CXCR3、およびCXCR4を含む、ケモカイン受容体の広範囲を発現する（しかし、CCR3およびCCR7を発現しない）、 インビトロおよびインビボの両方で ^5,16、機能的に活性である。このように、systemicaLLYのNPCは、炎症を起こしたCNSのレベルで蓄積する、Gタンパク質共役受容体（GPCRは）とともに、これらのCAMを使用して注入した。逆に、NPCは、血管や脳脊髄液の空間ルート² を介して中枢神経系を入力しない健康なマウスに全身的に注射。 CNS炎症、または化学的に誘発された脳炎のモデルとして、全身性サイトカインまたはlypopolisaccharide（LPS）の注射後に内皮/上衣細胞の活性化は、脳や脊髄の²に全身に注入されたNPCの蓄積が必要である。このようにして、全身のNPC療法とCNSの成功ターゲティングは、脳と脊髄環境が蓄積とのNPCの経内皮移動に資するである、機会（ウー）の病気特定のウィンドウの識別に依存している。このような条件は、一般的に、急性および亜急性炎症¹⁷のコンテキストで発生する。一度、未分化のNPCを移植し、中枢神経系に入ったマウスの臨床病理学的な特徴だけでなく、EAEを持つ大規模、ヒト以外の霊長類を改善することが示されている。これはに応じて最小限の細胞置換²および非CNS炎症を起こした領域^19,20（ 例えばリンパ節）VS血管周囲のCNS ^{​​2,5,6,18}内の免疫調節および神経保護パラクリン因子の分泌が顕著で依存していることが記載されている炎症細胞シグナル伝達は、免疫細胞^の浸潤を⁵により誘発される。

ここに我々は、慢性EAEのマウスモデルに、体のNPCの全身注射の主要な方法論の側面を説明します。具体的には、我々は我々が（i）に設置していたプロトコルを展開し、派生して、大人のC57BL / 6マウスの脳室下帯（SVZ）からの移植体細胞のNPCの準備を定義します。 （ii）は、マウスの慢性EAEを誘導し、（iii）の（ 静脈内または脳室内投与 ）治療的に有効な全身を行うNPC移植iをNTO EAEマウス。

プロトコル

動物に関わるすべての手順は、動物の下で、英国内務省が承認した実験動物のケア（科学的処置）法第1986（SPにPPL番号2457分の80）の原理に従って実行されます。

成体マウスの脳の脳室下帯（SVZ）からの体性神経幹/前駆細胞（NPCの）の1。導出

1. 解剖器具やメディアの準備
   NB：解剖の楽器は（それはパパインを希釈するのに役立ちますし、酵素活性を最適化します）準備ができて、使用前に37℃以上、20〜30分で温めておいている前に、これらの2つの溶液を1〜2時間を準備する必要があります。
   
   1. 1ストレート鋭いはさみ、1小さな外科はさみと2の小さな湾曲した鋸歯状の鉗子をオートクレーブ。
   2. 「消化」ソリューション：で2の別々の50mlチューブを準備します。
      溶液＃1：25ミリリットルアール平衡塩溶液（EBSS）+10 mgのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）+10 mgのL-システイン;と
      溶液＃2：25ミリリットルEBSS + 50mgのパパイン。
   3. 「完全な増殖培地 '（CGM）を準備し、マウス増殖サプリメントとの完全なマウス基礎培地、0.002％、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF; 10 ng / mlの）ヘパリン、上皮成長因子（EGF、20 ng / mlの）、および抗生物質を（ペニシリン/ストレプトマイシン）。
2. 脳解剖
   NB：頭骨の除去が容易であるため、その切れ味の組織を損傷する可能性があります。これを回避するには、しっかりと鉗子で骨を固定して、全体の骨が取り除かれるまで引き抜いてください。
   
   1. のNPCのすべての準備のため、頸椎脱臼によりカルN = 5-7、4-8週齢のC57BL / 6マウス。
   2. （水中）の70％エタノールカリングマウスの毛を清潔にし、頭部を除去するためのストレート鋭いハサミで耳の後ろカット;
   3. 頭蓋骨を覆う皮膚をカットし、小さな外科はさみを使用して正中切開を行います。ピンセットを用いて、·エクスポズに皮膚の2のパッチを畳む頭蓋骨をメール。
   4. 小さな外​​科はさみで頭蓋骨の基部に二つの小さなカットを行い、脳橋/髄​​質（腹側頭骨）の下で骨を取り除く。頭骨を引き出して進みます。同じはさみで脳の表面に損傷を与えることなく、球根にベースから始めて、すべての頭蓋骨に沿って切断を行う。また、頭頂骨の除去を容易にするために、前頭骨と目の間のカットを行う。 2ピンセットで外側に向かって頭頂骨のそれぞれを引っ張って頭蓋骨を除去し始める。引きながら、骨が取り除かれているときの脳に損傷を与えることができ、髄膜に注意を払う。
   5. 頭蓋骨が削除されると、完全に左に髄膜を分離するために、脳と頭蓋骨の間に鉗子をスライドさせます。静かに頭蓋骨から脳を持ち上げる。脳を解放し、最後に冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄チューブ内に脳を収集するために視神経を切断する。
   6. 氷のANにチューブを保つすべてのマウスに同じ手順を繰り返しますdが。
3. SVZの解剖、ニューロスフェアの形成と維持アッセイ
   セル×希釈倍率の平均数×10 ⁴
   
   10 ^4は、血球計数器室（ - > 10〜4センチメートル³ - > 10〜4ミリリットル総体積= 0.1 mm ^3で ）の総体積の変換を表す。両方とも、希釈係数を考慮するときにCGM及び生体染色で行わつが考慮に入れなければならない。 160細胞は、4隅の正方形で計数されている場合の例として、細胞懸濁液の最終密度（細胞/ ml）になる。
   
   4分の160×5（CGMでの希釈）×2（生体染色による希釈）×10 ⁴
   
   1. 解剖顕微鏡を装備した解剖フードをオンにします。
   2. 70％エタノール（水中）でのすべての表面を洗浄し、汚染の危険性を低下させる抗マイコプラズマ溶液でスプレー。
   3. カバー滅菌ガーゼとビーカーの底には、（鋭利​​な楽器を保持するために）および70％エタノール（水中）でそれを埋める。ビーカーに鉗子の2ペア、1マイクロはさみ、外科刃を浸します。
   4. 脳スライサー行列に脳全体を配置します。
   5. 2かみそりの刃を使用しても、前のカットに冠状切片視索除く脳の前極から2ミリメートル、および3ミリメートルの後部を行う。ときれいなペトリ皿に組織を置く。
   6. 解剖顕微鏡下で、SVZの組織を分離し、虹彩切除ハサミを使って1ミリメートル³片に切断。すべての脳のために繰り返します。
      1. 脳を解剖し、SVZsを消化する準備ができているされた直後に0.22ミクロンのフィルターで2ソリューション（セクション1.1.2）を超えるとフィルターよく混ぜる。
   7. 「消化」溶液30ml中に切片を移し、穏やかa10のmlピペットを用いて再懸濁し、3℃で30分間インキュベート5％CO ₂中で7℃。 15分毎に静かに2〜3倍のチューブを横に振る。
   8. 10分間300×gで遠心分離する。
   9. 上清を除去し、単一細胞懸濁液を得るまで、P200のピペット（10〜20倍ずつ）で最初のP1000で、次いでピペッティングすることにより、CGM200μlにペレットを再懸濁します。
   10. CGMと5ミリリットルに懸濁物を取るとT25のCM ²フラスコに移す。
   11. in vitroで 5-7日後（DIV）ニューロスフェアを形成することになる。 150×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機10分に停止を収集します。
   12. 上清を除去し、CGMを200μlにペレットを再懸濁します。
       単一細胞懸濁液を得るまで、P200ピペットを用いて細胞100-150Xを継代することにより、機械的にニューロスフェアを解離し、CGMで1ミリリットルにそれを取る。
   13. 1:5希釈を得るために、CGMの40μlの細胞懸濁液、 例えば 、細胞懸濁液10μlを希釈し、よく混ぜます。 dilut10μlのミックス生体染色液10μlとE細胞懸濁液とよく混ぜる。
   14. 生体染色液1:1の細胞懸濁液10μlを血球計カウント室を埋める。別途4隅の正方形に（白）生死（青）セルの数を数える。細胞/ mlの数を確認するには、次の計算を適用します。
   15. 5 CGM mlおよびT25のCM ²フラスコへの転送中に再懸濁し、2×10 ⁵細胞;
   16. 各項1.3.11-1.3.12ごとに4-5 DIVを繰り返します。以降展開の第二通路から、生体染色排除により細胞生存率を評価し^、21が説明されているように、クローン密度（8,000 cells/cm2）でのNPCをメッキすることにより、継続的な成長曲線を構築し始める。細胞数を維持し、手順ごとに4-5 DIVを繰り返します。次のように継続的な成長曲線を生成するには、手順に従います。
       NB：4-5 DIV球は150〜200ミクロンの直径に到達している必要があります後に、優れた細胞調製を持っている。 Tの良好な推定値を持っている彼は細胞密度は、血球計数器を通して良好に分布、オーバーラップしないセルを有するために最適希釈率を見出すことが重要である。理想的には50〜200個の全細胞の間があるはずです。数えるときは、境界線を触れることなく、正方形に含まれる細胞のみが考慮されなければならない。また、細胞の生存率は、健康な製剤を有することが重要な要素である。重要なのは、それが90％大きくなければなりません。線形成長曲線は、健康な細胞調製のもう一つの指標である。
       
       1. 生細胞と死細胞の数（ 例えば 1.3×10 ^6）を数える。
       2. 播種した細胞の数（ 例えば、1.3×10 ^{6/2×10 5} = 6.5）により、生細胞の数を割る成長速度を規定する。
       3. （= 2×10 ^5の開始時）は、前の時点で存在する細胞の総数の成長率を乗算することにより細胞の総数を計算する。
       4. 平均値を報告7;線形トレンドラインを構築するための標準偏差。
   17. 通路6から開始し、機械的解離は、酵素的解離に置き換えられます。 10分間150×gで遠心分離後、上清を除去し、細胞凝集体解離溶液200μlにペレットを再懸濁し、P200と7 - 8倍速を再懸濁し、37℃、5％CO ₂で10分間インキュベートする_。
   18. 単一細胞懸濁液を得て、CGMの800μLを追加するには、P200と7-8Xを再懸濁します。 （生存および死亡の両方）細胞をカウントし、その実行可能性を確立します。再懸 ​​濁2×10 ⁵ CGMの5ミリリットル中の細胞とT25のCM ²フラスコに移す。
4. in vivoでの細胞追跡のためのNPCのウイルス導入
   NB：形質導入形質導入したNPCと並行して成長曲線を構築し、ウイルス形質導入の効率を確認します。また、それは、ニューロスフェア形成細胞の絶対数は、細胞内に存在するクローンた準備効率であるたTiONまたは（ヨウ化プロピジウム、PIを有する）DNA含有量による細胞周期解析は、細胞状態のさらなる適応症として使用することができる。感染細胞のパーセンテージが良好であってはならない場合、ウィルストランスダクションのプロトコルは、細胞の同じ集団で二回繰り返すことができる。感染のレベルは良好であり、成長曲線は、野生型細胞で得られたものと同様であると、形質導入されたNPCは膨張および/または移植することができる。
   
   1. 神経球を採取し、単一細胞懸濁液を得た。 10ミリリットルCGM高密度（T75センチ²フラスコ内の1.5×10 ⁶細胞）で細胞をプレート。
   2. 12時間は、第三世代のレンチウイルスベクターpRRLsinの3×10 ⁶ TU / mLを加えた後。 PPT-HCMVは、Eを用いて操作β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）又は緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて大腸菌由来。
   3. 48時間後、10分間、300×gで細胞を収穫し遠心分離し、1:1の比率で細胞をreplate。
   4. 後にin vitroでの 3通路は、感染効率を確認します。フローサイトメトリーは、一般に感染の効力を試験するために使用され、感染の満足できるレベルは、一般に、陽性細胞75〜95％の範囲であることが認められている。マーカー発現の維持を確認するために、拡張の3さらなる継代後に再び感染の効率を確認してください。
5. ニューロスフェア凍結
   1. 、T25のCM ²フラスコからニューロスフェアを収穫10分間300×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。
   2. 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）を含む培地（CGMの凍結1mlでペレットを再懸濁。
   3. 冷凍コンテナ内に-80℃で凍結バイアルを置きます。
   4. 少なくとも24時間後ヶ月間-80℃でcryoboxおよび格納するためにセルを移動するか、長期保存のために液体窒素に（N _2）をもたらす。
6. ニューロスフェア解凍
   NB：長時間接触oの毒性効果を回避するためにDMSOで女NPCは、解凍プロセスは、可能な限り高速である必要があります。
   
   1. C / N ₂ -80℃からクライオバイアルを取り外し、ドライアイス上に保管してください。
   2. ほとんどすべての細胞懸濁液を解凍し、氷懸濁液の小片のみが残るまで迅速に、水浴上でバイアルを解凍する。
   3. 温めておいた新鮮なCGM 5mLで細胞懸濁液を再懸濁します。
   4. 10分間300×gで遠心分離する。
   5. 上清を除去し、新鮮なCGMの5ミリリットルときれいな、未処理のT25 CM ²フラスコ中の細胞懸濁液をプレートで軽く懸濁します。
7. 1.7）のNPCキャラクタリゼーション
   NB：最後の洗浄はPBS真菌の増殖または汚染を防止するために、0.05％アジ化ナトリウム、PBSで置換することができ、カバースライドを2〜3週間、4℃で保存する。
   
   注意：細胞内マーカーのために染色するためにブロッキング溶液中で、PBSに浸透化剤を追加します。一次抗体の供給源は、ヤギ、ウシ血清albumiである場合N（BSA）またはヤギ以外の血清を使用する必要があります。
   
   注意：細胞内マーカーは、一次抗体溶液中で浸透化剤を使用するために染色する。
   
   1. 24ウェルプレートの底に13ミリメートルのガラスcoverslideを配置します。小滴を作成するために、各coverslideの上にコーティング溶液150μlを加える。 37℃、5％CO ₂で少なくとも30分間インキュベートする_。
   2. 神経球を採取し、単一細胞懸濁液を得るために解離する。
   3. 生きた細胞を数え80,000 cells/35μLを取得するために希釈する。穏やかな吸引によってcoverslideから塗布液の過剰を削除し、細胞懸濁液35μlのプレート。
   4. 37℃、5％CO ₂で25分間インキュベートする。細胞が付着し始めている場合は、速やかにコントラスト位相差顕微鏡で確認してください。
   5. 適切なサプリメント（ 表1参照）および抗生物質（Peを用いて、基礎マウスの媒体を混合することにより、分化培地を調製N /ストレプトマイシン）。
   6. 分化培地400μlのを追加し、37℃、5％CO ₂でインキュベートする_。
   7. 3 DIVの後、新鮮な分化培地で培地の半分を変更してください。
   8. 6 DIV後、培地を除去し、PBSで1回洗浄する。化学フードの下で、PBSを除去し、予め温め、4％パラホルムアルデヒド（PFA）4％ショ糖の300μlを加える。室温（RT）で5分間インキュベートする。 PFAを削除し、PBSで3回洗浄します。
   9. 免疫細胞を続行するには、PBSを除去し、PBS 10％正常ヤギ血清（NGS）（ブロッキング溶液）でブロックし、室温で1時間インキュベートする。
   10. ブロッキング溶液を除去し、PBS、1％NGSで希釈した所望の一次抗体を加える。代わりに、120分、RTで4℃、CO / Nまたは、インキュベートする。
   11. インキュベーション後、PBSで2回洗浄します。 PBS、1％NGSで希釈した適切な二次抗体とインキュベートします。室温で60分間インキュベートする。
   12. PBSおよび4 '、6 - ジアミジノで対比染色した核を洗浄2X2 - フェニルインドール（DAPI）をPBSは暗闇の中で、室温で3分間透過性化剤で1:20,000に希釈した。蒸留水で1回、PBSで2回洗浄してください。
   13. ガラス組織スライド上に封入剤のドロップを入れて、ピンセットで封入剤に直面して細胞とcoverslideをマウントします。静かに封入剤を過剰に絞り出すcoverslideを押してください。封入剤が乾燥するまで室温で暗所にcoverslideのままにして、4℃で保存する

C57BL / 6マウスにおける2。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）誘発実験的自己免疫

1. エマルションの調製
   1. ガラス製ビーカーに、エマルジョンの総量ことを考えると、結核菌の4ミリグラム/ mlを含む不完全フロイントアジュバントで構成エマルジョン[それ以外の完全フロイントアジュバント（CFA）として定義]およびMOG200μgの（ペプチド35〜55）を調製マウスあたり300μLになります。
      NB：AppropriaCFA中MOG免疫マウスのTEコントロールは、CFAで免疫したマウスである。 MOG免疫マウスにおける疾患発症の期待分散は11.3（1.8±）dpiです。
      
      NB：必要とされるエマルションの総体積を計算する場合、免疫するマウスの数の二倍の体積を考慮する。ガラス製品は、エマルジョンの一部の無駄を最小限にするためにプラスチック容器に好まれるべきである。
      
      1. ガラスシリンジは、常に氷上で乳濁液を維持し、約30分間、19 G針ブレンドを保持している。
      2. エマルジョンの準備ができているかどうかを確認するには、水に乳化、少量のドロップします。エマルションは、それがあり、分散しないように、ドロップが残っている場合にのみ注入される準備ができている。
      3. CFAのみでマウスの対照群を免疫する。実験マウスの治療CFA中MOGと（MOG免疫化）。 MOGにおける疾患発症の期待分散はマウスが11.3（1.8±）dpiです免疫した。
   2. 1ミリリットルのプラスチックシリンジaに19 G針を転送NDエマルジョンを吸引除去する。泡を避けるため、25 gの針を変更して、氷の上で注射器を残す。エマルジョンで満たされた注射器は、使用する準備ができていると時間のカップルのための氷上で保存する。
2. 予防接種
   1. 温暖ボックスに（6〜8週齢、メス）マウスを置き、尾静脈を拡張することを可能にするために約10分間待ちます。
   2. マウスレストレーナーに温暖ボックスから1マウスを転送します。マウスの動きを防ぐために、拘束を閉じます。
   3. 泡を作る避け百日咳毒素（5μg/ ml）を100μlと1ミリリットルのインスリン注射器を埋める。ゆっくり尾静脈中の溶液を注入する。出血をプラグインする一枚の紙に数秒間針を押して削除します。
   4. 背面ケージにマウスを置き、すべてのマウスに同じ手順を繰り返します。
   5. 連続イソフルラン吸入（1〜2％、2リットル/分）でマウスを麻酔し、レベルのエマルション皮下100μlのを注入2のフランクと尾の付け根（300μlのエマルジョン/マウス）の。ゆっくりとエマルジョンの漏洩の回避、注射器を取り外します。
   6. マーク耳パンチャーとマウスは、ケージにマウスを置き、完全に回復するまで、チェックしてください。すべてのマウスについて繰り返します。
   7. 48時間後（2日後の予防接種、DPI）の繰り返しセクション2.2.3。
3. EAEマウスの行動解析
   1. 5解像度から出発して、毎日マウスを秤量し、 表1に記載のスケールのスコアリングシステムを使用して、それらの運動パフォーマンスを監視する。

尾静脈内に神経幹/前駆細胞の3。注射（IV）

1. 細胞調製
   1. 10分間300×gで遠心分離することによって収穫ロスフェア。
   2. 上清を除去し、細胞集合体解離溶液200μlを加える。 37℃、5％CO ₂で10分間インキュベートする_。
   3. 静かに10-12X（avoidinを再懸濁gが単一細胞懸濁液が得られるまでP200で）気泡およびCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}を含まない基本培地を800μlに取る。
   4. 10 ⁶ cells/150200μlの最終濃度を得るために、細胞生存率をアッセイおよびCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}を含まない基本培地で懸濁液を希釈する生体染色を用いて細胞を数える。使用するまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
2. NPCの静脈注射
   NB：単一細胞懸濁液中に解離し、理想的に気泡がないことは、静脈閉塞およびその結果として死亡する可能性があり、塞栓形成の対のいずれか塊/アグリゲートの危険性を低減するために考慮すべき2つの重要な側面である。
   
   1. 病（16〜18 DPI）のピーク時には、マウスの重量を量るとスコア。均質なグループを持っているために、そのスコアに従ってマウスを配布します。
   2. 温暖ボックスにマウスを置き、尾静脈を拡張することを可能にするために約10分間待ちます。
   3. マウスレストレーナーに温暖ボックスから1マウスを転送します。マウスの動きを防ぐために、拘束を閉じます。
   4. 細胞懸濁液150μlで1ミリリットルのインスリン注射器を満たし、すべての気泡を除去することを確認してください。ゆっくり尾静脈に溶液を注入する。出血（ 図6Aおよび6B）をプラグインする一枚の紙を数秒間針を押して削除します。
   5. ケージにマウスを置き、回復するまで確認してください。すべてのマウスに同じ手順を繰り返します。

4。大槽（ICV）への神経幹細胞/前駆細胞の注射

1. 細胞調製
   1. 10分間300×gで遠心分離することによって収穫のNPC。
   2. 上清を除去し、細胞集合体解離溶液200μlを加える。 37℃、5％CO ₂で10分間インキュベートする_。
   3. 優しく単一のCが得られるまで、P200と10-12Xを再懸濁エルサスペンションおよびCa ^{2 +}およびMg ^{2 +を}含まない基本培地を800μLに連れて行く。
   4. 細胞を計数し、所望の細胞密度を得るためのCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}を含まない基本培地で懸濁液を希釈する。使用するまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
2. 4.2）のNPC ICV注射
   1. 病（16〜18 DPI）のピーク時には、マウスの重量を量るとスコア。均質なグループを持っているために、そのスコアに従ってマウスを配布します。
   2. 連続イソフルラン吸入（1〜2％、2リットル/分）の下で定位固定装置上にマウスを置きます。耳のバーをマウスの頭部を固定します。そして、口と鼻の部分の両方を調整してください。マウスの頭が平らで固定されていることを確認します。
   3. ポビドンヨード（PVP-I）をマウスの頭部を綿棒頭蓋骨を露出させ、ヘッドの後方部分に皮をカットする切開する。
   4. マイクロマニピュレーターを用いて、マイクロLの先端を挿入する首の後ろで正中線にそのまま筋肉や靭帯を通して後頭部とアトラス脊椎骨間の裂け目にITERの注射器。針の屈曲部^22に記載されるように、全長にわたって後頭部の内側表面に密着して保持される。
   5. ゆっくりと針を挿入し、数秒待ってください。オペレータは、針が細胞調製を注入開始前のマウスの頭蓋骨は、「フック」しているような感覚を認識することを学ぶためのものです。ゆっくり（3〜5分以内に）細胞の量を注入する。注射の後に追加の数秒間の場所に針を残し、ゆっくりとシリンジを取り外します。
   6. 肌をステッチし、完全に回復するまで回復ケージにマウスを置きます。

5。組織処理

1. 深く0.5mlのケタミン（100 mg / mlで）の混合物でマウスを麻酔し0.25ミリリットルキシラジン（23.32 mg / ml）を4.25 mlの滅菌水を灌流し、transcardically、ワット生理食塩水-EDTAで灰化し、4％PFAで固定。 4℃で12時間、4％PFA中脊柱、脳やPostfixの両方を削除PBS中で組織を洗浄し、骨から脊髄を除去し、4℃で（PBS中）、30％スクロース中の組織に少なくとも48時間を残す^2を説明するように、最適な切削温度（OCT）化合物中の組織を埋め込 ​​み、液体窒素で凍結スナップ。
2. 10月12日厚スライスで組織をカットするミクロトームを使用してください。
3. 別の方法として、アガロースで新鮮な組織を埋め込み、ビブラトーム50〜80ミクロンの厚さのスライスを使用して組織を切断する。
4. 両方の場合において、5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β核β-ガラクトシダーゼ活性を検出するためのD-ガラクトピラノシド（X-galで）溶液中、37℃でO / Nインキュベートする。
5. アストロサイト（50μg/ ml）を、神経細胞のための抗神経核抗原（NeuNの）ためにantiglial線維性酸性タンパク質（GFAP）を使用して、5ミクロンスライスおよび二重染色にβ-GAL +細胞を含むセクション（1＆を再編集＃956;グラム/ ml）および未分化神経細胞（10μg/ ml）を用antiNestin。
6. のセクション1.7.11と1.7.12で説明したように進んでください。複数の染色のために異なる蛍光体と接合した二次抗体を使用してください。
7. 5.1から5.3のステップで説明し、複数の染色を進めるように、GFP標識した細胞を含む組織のために進んでください。
8. スライドに封入剤を数滴を追加し、組織カバーガラスでカバーしています。
9. ビオチン標識抗体で染色した切片を、アビジンビオチン複合体の溶液を調製し（ABC溶液は 、 表2を参照）、45分間攪拌中のままにした。
10. 内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために1％のH ₂ O _2を用いてスライス5分間インキュベートする。
11. PBSで2回洗浄します。
12. 室温で1時間のためのABC溶液でインキュベートする。
13. PBSで2回洗浄します。
14. 3,3 ' -ジアミノベンジジン溶液および0.3％H ₂ O ₂でインキュベートする。反応国連を監視顕微鏡をデアとすぐスライスブラウン（通常約5〜10分）を取得を開始として、PBSで洗浄する。
15. PBSで2回洗浄し、ステップ5.7で説明したように進んでください。

材料および試薬の包括的なリストを表2に示す。

結果

NPCの派生と特性評価
SVZ解剖は、機械的および酵素的解離（ 図1A）によって6〜8週齢のC57Bl / 6マウスのた（n = 5-7マウス/プール）のプール上で行われる。 CGMにおける培養の数日後、自由に浮遊ニューロスフェアは、（ 図1Aおよび1B）を形成し始める。主な球を回収し、機械的に、すべての4-5 DIVを継代する。継代時には、生細胞および死細?...

ディスカッション

体性幹細胞に基づく治療は、例えば、MS2 ¹¹などの慢性炎症性CNS障害を治療するための最も有望な戦略の一つとして浮上している。その治療効果を維持するメカニズムはまだ完全に解明される必要があるが、神経変性疾患の様々な実験モデルにおいて、NPC移植の重大な影響は、細胞がすぐにヒトでの研究にも適用することができる幹やや挑発的な信念に上昇を与えている。しかし、我?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100