表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

要約

単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。

要約

組織中の細胞外マトリックス（ECM）は、厳密に調節繊維径、組成および組織と3D繊維状タンパク質ネットワークを形成する細胞によって合成され、組み立てられる。構造的支持を提供することに加えて、ECMの物理的および化学的特性、接着、分化、およびアポトーシスを含む多数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。 インビボで 、ECMは、タンパク質内の潜在性自己組織化（線維化）部位を露出させることによって組み立てられる。このプロセスは、異なるタンパク質を異なるが、フィブロネクチン（FN）原線維は、十分に特徴付けされ、細胞媒介ECMアセンブリのためのモデル系として働く。具体的には、細胞が不溶性繊維にアセンブリのための結合部位を展開し、公開するために、FNの二量体およびアクトミオシンで生成された収縮力を結合するために、細胞膜上のインテグリン受容体を使用しています。この受容体を介したプロセスは、組織SCAに携帯からECMを組み立て、整理するために、細胞を可能にしますレ。ここでは、ECMタンパク質をアンフォールドし、不溶性繊維にそれらを組み立てるために、タンパク質 - 表面相互作用を用いて細胞媒介性マトリックス立体を再現する方法と呼ばれる表面開始アセンブリ（SIA）を提示する。まず、ECMタンパク質は、それらが部分的に（アンフォールド）変性させ、潜在的結合ドメインを露出疎水性ポリジメチルシロキサン（PDMS）表面に吸着される。折り畳まれたタンパク質は、その後、熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上にマイクロコンタクト印刷により明確に定義されたミクロおよびナノパターンの中に転送される。グラフティングの熱トリガー溶解が最終組み立てと明確に定義された形状を有する不溶性ECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造の放出をもたらす。複雑なアーキテクチャは、マイクロコンタクト印刷に使用するPDMSスタンプ上に定義されたパターンを操作することによって可能である。ラミニン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンIおよびIVは、多成分ECMのnanostrucを作成するために入力してFNに加えて、SIAプロセ​​スを使用することができるトゥーレス。このように、SIAは、 インビボで ECMの構造及び組成を再現するために、タンパク質組成物、繊維形状及び足場アーキテクチャを高い精度で制御するECMタンパク質ベースの材料を操作するために使用することができる。

概要

組織中の細胞外マトリックス（ECM）の接着、増殖、分化、およびアポトーシス^1-3を含む複数の細胞プロセスの物理的および化学的調節に関与する多機能性タンパク質で構成されている。 ECMは、合成され組み立てられ、かつ細胞によって組織され、構成タンパク質線維は、組織の種類と発達段階に応じて変動独特の組成物、繊維サイズ、形状及び相互接続されたアーキテクチャを持っている。最近の研究は、ECMの組成および構造の点でECMをrecapitulatingする組織工学および生物工学用途のためのバイオミメティック材料の開発を可能にするかもしれないことを示唆している、操作された組織^4を形成するために細胞を導くために有益な手がかりを提供することができることを実証した。

製造方法の数は、組織中のECMの態様を模倣することができるポリマー足場を設計するために開発されている。例えば、エレクトロスピニングと位相SEPARATIONは、両方のダウン数十マイクロメートルから数十ナノメートル^5-7の範囲の直径を有する繊維の多孔質マトリックスを形成する能力を実証した。両方の技術はまた、ナノファイバーの高度に多孔性マトリックスが足場⁸への細胞接着および浸潤をサポートできることを示している。しかしながら、これらのアプローチを作成することができる可能な繊維の幾何学的形状、配向および3次元のアーキテクチャで制限される。相分離がランダムに配向した繊維で足場を作り出すのに対して、電界紡糸は、一般的にランダムに配向または高度に整列いずれかの繊維と足場を生成します。材料の制限は、研究者は、典型的には、ポリ続いて、細胞接着を促進するために、ECMタンパク質でコーティングされている（ε-カプロラクトン^）8、ポリ（乳酸-co-グリコール酸^）9などの合成ポリマーを用いても存在する。天然のバイオポリマーはまた、コラーゲンタイプI ^10、11、ゼラチン、フィブリノゲン¹²を含め、使用されているキトサン^13、シルク¹⁴が、ネイティブ組織に見られるタンパク質の小さなサブセットのみを表しています。ほとんどの組織は、既存の方法を使用してナノファイバーを製造することが困難または不可能であるフィブロネクチン（FN）、ラミニン（LN）、IV型コラーゲンおよびヒアルロン酸などのECMタンパク質および多糖類の大きい環境を含む。

この課題に対処するために、我々は彼らの周囲のECMタンパク質の線維を組み立て、整理、細胞が合成する方法を模倣する上で我々の研究努力を集中してきた。特定の線維形成プロセスが異なるECMタンパク質によって異なりますが、一般的に、ECMタンパク質分子の立体構造変化は、暗号のような自己組織化サイトを公開し、酵素や受容体を介した相互作用によって引き起こされます。ここでは、より良い線維形成過程を理解するためのモデル系として、FNを使用しています。簡潔には、FNホモダイマー、第10タイプIIにRGDアミノ酸配列を介して細胞表面上のインテグリン受容体に結合する私はユニットを繰り返します。一度結合すると、インテグリンは、アクトミオシンの収縮を経由して離れて移動して、暗号のような自己組織化サイトを公開するために、FNの二量体を展開。これらのFN-FN結合部位の露出は右のセル表面¹⁵に不溶性の線維に組み立てるために、FNダイマーを可能にします。無細胞系での作業は、不可解なFN-FN結合部位は、空気-液体-固体界面^17から19に、変性剤¹⁶又は表面張力を使用して展開を通じて明らかにすることができることを実証した。しかしながら、これらの技術によって作成されたFN繊維は、特定の繊維のサイズおよび形状に制限され、典型的には表面に結合される。

ここでは、アプローチが自立不溶性ナノファイバー、nanofabrics（2Dシート）および単一または複数のECMタンパク質からなる他のナノ構造を作成するために、タンパク質-表面相互作用を利用することによって、これらの制限を克服する表面開始アセンブリ^{（SIA）20（} 図1と呼ばれる記述）。このP INrocessは、ECMタンパク質は、パターン化された、疎水性のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの上にコンパクトな球状溶液中のコンホメーションと部分的に変性（アンフォールド）から吸着される。 ECMタンパク質は、次いで^、22マイクロコンタクト印刷^を介して熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上に、この状態で転送される。 40°Cの水で水和するときグラフティングは、固体のままであるが、32℃に冷却したときに、それが親水性となる下限臨界溶液温度（LCST）を通過し、水で膨潤し、次いで溶解するのオンオフ組み立てられたECMのナノ構造体を解放する表面。 SIA法は、ナノメートルスケールの精度で寸法を制御します。そのような組成物、繊維形状、アーキテクチャなどの重要なパラメータを制御することにより、 インビボで見出さECMの多くの特性を再現し、組織工学及びバイオテクノロジーの用途のための高度な足場を開発することが可能である。

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プロトコル

フォトリソグラフィを用いてマスター型の1。作製

1. ECMタンパク質ナノファイバー、nanofabricsおよびナノ構造を作製する第一のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを用いて設計される。このCADファイルは、フォトマスクに転写される。フォトマスクの種類は、特徴の解像度に依存します。機能の十分な透明性ベースのフォトマスクが約10ミクロンにまでサイズで。小さなフィーチャ<10μmのガラスフォトマスク上のクロムが必要になります。ここで紹介するナノファイバーとナノ構造のすべてが透明ベースのフォトマスクを用いて作製し、このように横方向の寸法の厚さにナノメートルスケールであったが、されませんでした。
   注：これは、（正または負）フォトレジストの種類と共に、このような（UV光を通過させる）フォトマスクの領域が暗くなるもの（通過するUV光を防ぐ）と透明になるものを区別することが重要である、マスター型の最終形状を決定することになる。
2. マスターモールドの製造を開始するために、15分間150℃に設定したホットプレート上に置くことで4 "シリコンウェーハを脱水。
3. スピンコーターの真空チャック上のウエハをセンタリング。ウェハの真ん中にSU-8-2015ネガ型フォトレジストを注ぎ、ウェーハの約3分の2が覆われるまで同心円状に注ぐ続けています。
   注：泡の発生を最小限に抑えるために注ぐときに近いウェハSU-8のボトルを保管してください。
4. 次のようにスピンコーターをプログラム：
   • スプレッドサイクル：10秒100回転/秒の加速で500回転。
   • スピンサイクル：30秒100回転/秒の加速で4000回転。
   注：このスピンコーティングレシピの厚さが〜10μmであるフォトレジスト層を形成する。紡糸速度SU8又は製剤を変更することにより、厚さを調整することができる。
5. ソフト3分間95℃に設定したホットプレート上に置くことで、ウェハを焼く。
6. を介してUV光でウエハを露光140ミリジュール/ cm ²の総投与用のフォトマスク。
   注意：SU-8は、したがって、UV光がフォトマスクを通過することができる領域は、開発した後に残り、マスターモールド上の隆起になるネガ型フォトレジストである。
7. 4分間95℃に設定したホットプレート上に置くことによって、ウエハ焼く露出を投稿してください。
8. 3分間のSU-8の開発者に置くことで、ウェハを開発しています。 3分後、イソプロピルアルコールでウエハをすすぐ。白色フィルムは、すすぎの間に生成される場合、ウェーハは完全に開発されるものではなく、別の30秒間現像剤に戻されるべきである。イソプロピルアルコールで再度洗い流す。白色フィルムは、イソプロピルアルコールすすぎ時に形成しなくなるまで、このプロセスを繰り返します。
9. ほこりから保護するために150ミリメートルペトリ皿中の窒素と場所の流れの中で、ウェーハを乾燥させます。

2。PDMSスタンプを作る

1. エラストマーベースを組み合わせ、中に硬化剤でのPDMSプレポリマーを製造10時01 w / wの比率。典型的には、塩基及び硬化剤8gの80gを厚さ1cmの層にマスターモールドをカバーするのに十分なPDMSがあることを確認するために使用される。
2. 混合し、次のように設定求心ミキサーを使用して、PDMSを脱ガス：
   • ミックス：2分間2,000 rpmで
   • ドガ：2分2000回転。
3. ミキサーが使用できない場合は10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて10分間、手でPDMSを混ぜる。気泡を除去するために30分間、真空デシケーター中に置くことによって混合物を脱気。
4. 厚さ1cmの層を形成したマスター型（パターン化されたシリコンウエハ）上で十分なのPDMSプレポリマーを注ぐ。 4時間又は48時間室温にて65℃で焼成することによりPDMSを硬化させる。
5. 一度硬化し、パターンを含む領域はPDMSスタンプを形成するために切り出すことができる。 PDMSスタンプの裏面側から特徴を区別するために、スタンプの裏側に角部の一方の外ノッチをカットする。

3。マイクロコンタクトのPrECMパターンのinting

1. きれいな直径25mmのガラス製カバースリップ65℃のオーブン中で1時間、次いで乾燥のために95％エタノール中で超音波処理による。
2. 濃度10％（重量/体積、10ml中の典型的には1 g）で1 - ブタノールにグラフティングを溶解させてグラフティング溶液を調製する。
3. 全体ガラス表面が覆われるようにグラフティング·ソリューションのスピンコーターピペットを200μlの真空チャック上のカバーガラスを中央に。
4. 1分間6000回転でカバーガラスをスピンコート。
5. 窒素の流れの下で30分、その後、乾燥のために50％エタノール中で超音波処理によって、PDMSスタンプを清掃してください。
   注：乾燥およびその後の工程はECMナノ構造セルで使用されるアプリケーションのための無菌性を維持するために、バイオセーフティキャビネット内で行われるべきである。
6. コー​​ト各PDMSのパターン化された表面は、タンパク質溶液200μl、FNのための滅菌蒸留水に、通常、50μg/ mlのでスタンプ。室温で1時間インキュベートする。
   注：のThボリュームをコーティングさは1.5センチメートル² PDMSスタンプのためであり、PDMSスタンプを用いECMタンパク質および溶液中のECMタンパク質の濃度の大きさに応じて調整する必要があります。
7. 過剰なタンパク質を除去し、窒素気流下で完全に乾燥蒸留水に、PDMSスタンプを洗う。
   注意：スタンプに残ってすべての水がカバースリップ上でグラフティングコーティングの早期解散の引き金と適切なタンパク質の転送を防ぐことができます。
8. 無菌製造のための、閉じたペトリ皿の内側にグラフティング·コートしたカバーガラスを配置し、UV照射を用いて滅菌し、生物学的安全キャビネット内のUV光下で45分間で十分である。無菌性が必要とされない場合は、このステップを省略することができる。
9. グラフティングでコーティングされたカバースリップに接触してPDMSスタンプの機能面を配置することによって、マイクロコンタクト印刷を実行します。必要に応じて、気泡を除去し、均一な接触を確実にするためにスタンプの背面を軽くタップする鉗子を使用。
10. 5マイルの後N、カバースリップからPDMSスタンプをはがし。
11. この段階で、追加のECMタンパク質は、より複雑で多成分構造体を作成するためにパターン化することができる。 3印刷物まで、このプロセスで動作することが確認されており、それ以上は実行可能である。

ECMナノファイバーおよびナノ構造の4。リリース

1. 35ミリメートルペトリ皿にパターン化されたグラフティングコーティングされたカバーガラスを配置し、位相差顕微鏡を用いたパターン忠実性を検査します。パターンに応じて、CCDカメラは、パターンの特徴を解決する必要があるかもしれない。蛍光顕微鏡はまた、ECMタンパク質が蛍光標識された提供されたパターンを検査するために使用することができる。
2. ペトリ皿に40℃の蒸留水3mlを加え、水が徐々に冷却します。
3. グラフティング層の溶解およびECMタンパク質の放出パターンは、位相差顕微鏡を用いてモニターすることができる。アプリケーションは、光学TECの使用を許可しない場合hniques、放出は、溶液温度を測定することによりモニターすることができる。典型的には、水は、ECMタンパク質ナノ構造体が解放されたことを確認するため、ウェルグラフティング（32°C）のLCSTより下、室温に冷却する。
4. リリース後、ナノファイバー、nanofabrics、その他のナノ構造は、水に浮かんでいる。それらを使用する更なるアプリケーションのためにそれらを操作する必要がある。正確なアプローチは、実験の目的に依存し、そのような、別の表面上に固定化するマイクロマニピュレータシステムに移動するか、ヒドロゲル中に埋め込むようなステップを含んでもよい。

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結果

SIAは、ファイバの寸法を高い精度で制御するエンジニアリングECMタンパク質ナノファイバーが可能である。これを実証するために、50×20μmの平面寸法、Fnとナノファイバーの配列は、グラフティングコーティングされたカバーガラス（ 図2A）上にパターン化された。グラフティング表面にパターン化されたときに（ 図2B）、固有のプレストレス下にあったため、放出...

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ディスカッション

SIA法は、模倣細胞媒介マトリックスアセンブリここに提示され、調整可能なサイズ、組織と組成物とECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造のエンジニアリングを可能にします。細胞で生成されたECMとは同一ではないが、SIAは機械的ひずみ²¹の間に展開/折りたたみ可逆を受け、細胞を²⁰と結合すること^ができるナノスケールのタンパク質線維²⁰で構成され...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parts base with 1 part curing agent.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Human, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86