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要約

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。

要約

クロマチンは様々なDNA依存性プロセスを制御するDNAやタンパク質で作られた非常にダイナミックな核タンパク質複合体である。特定の領域におけるクロマチン構造および機能は、転写因子、およびDNAメチル化を含むヒストンの翻訳後修飾（hPTMs）および変異体、クロマチン結合タンパク質の局所的な濃縮によって調節される。個別の機能領域でのクロマチン組成のプロテオミクス特性評価は、これまで質量分析（MS）によるその後の詳細な分析のための適切な純度と量でそのようなドメインを豊かにするために、効率的なプロトコルの不足によって妨げられてきた。取クロマチン免疫沈降は、その機能、hPTMs、変異体および共同関連する非histonicタンパク質の面で明確なクロマチン領域を分離するために使用され、それによって我々は、ここにChroP（CHRO MATIN のP roteomics）という名前の新 ​​たに設計されたクロマチンプロテオミクス戦略を、している記述MSにより分析した。我々は彼を説明ヒストンH3上のリシン9のトリメチル化の存在によってマークされた転写サイレントヘテロクロマチン領域に濃縮および分析のためのChroPのの設定、再。達成された結果は、徹底的にヘテロクロマチンプロテオームを特徴付けるChroPの可能性を実証し、クロマチンの異なるタンパク質決定因子が相互作用し、遺伝子座特異的構造的および機能的な構成を確立するために、相乗作用方法を理解するための強力な分析戦略としてそれを証明する。

概要

クロマチンはすべてのDNA媒介プロセスの主要なテンプレートとして関与している非常に動的な核タンパク質複合体である。ヌクレオソームはクロマチンの基本的な繰り返し単位であり、DNAの147塩基対が、1,2ラップ回される各カノニカルヒストンH2A、H2B、H3及びH4、2分子を含有するタンパク質性八量体コアからなる。すべてのコアヒストンは、ヌクレオソームの外に突出している球状ドメインで柔軟なN末端 ​​「テール」として構成されている。クロマチン構造とダイナミクスを調節するための主要なメカニズムの一つは、主にヒストン3,4のN-末端に生じる共有結合性翻訳後修飾（PTMを）に基づいている。ヒストン修飾がヒストン-DNA間、またはヌクレオソーム間の接触を変化させることにより、高次クロマチン構造を変化させるため、DNA結合タンパク質（ シスメカニズム）のアクセスを制御することのいずれかによって機能することができ、又はdockinとして作用することにより調節タンパク質のために、単一のユニット、または多量体複合体に埋め込まれたようなグラム·サイト。そのような調節タンパク質は、異なる方法でその機能を発揮することができる：直接遺伝子発現（ すなわち、TAFタンパク質）を調節することによって、またはヌクレオソーム位置決め（ すなわち、クロマチンリモデリング複合体）を変えることにより、又は他のヒストン残基を修飾することにより（メチルトランスフェラーゼまたはアセチルを有する、すなわちタンパク質を転移酵素活性）（ トランスメカニズム）5。特定のクロマチン座で明確なPTMパターンクラスタは異なる部位で異なる修正が基本となるDNAの機能状態を仲介する分子コードを生成するために相乗作用がありという仮説の精緻化につながっていることを観察。 「ヒストンコード仮説は、「年間で大規模なコンセンサスを得ていますが、その実験的検証は技術的な限界6,7によって戻って開催されました。

質量分析（MS）ベースのプロテオミクスとして浮上しているヒストン修飾パターンをマッピングすると、クロマチン結合タンパク質8を特徴づけるための強力なツール。 MSは、ペプチドの実験と理論質量との間の特定のΔmassとして変更を検出します。個々のヒストンのレベルでは、MSは、それらの9月14日の間で新たな修正解きほぐすinterplaysの検出を可能に、PTMをマッピングする公平かつ包括的な方法を提供する。

近年、多くの戦略は、無傷の有糸分裂染色体15、可溶性hPTM結合タンパク質16-18の同定および特定のクロマチン領域の単離および分析の特徴付けを含む、クロマチンのプロテオミクス組成を分析するために開発されている（ すなわちテロメア）19,20。しかし、ヒストンPTMを、変異体、およびクロマチン関連タンパク質間の遺伝子座特異的相乗効果の調査はまだ不完全です。ここでは、（ChroPという名前の新しいアプローチを説明します我々は効率的に機能的に異なるクロマチンドメインを特徴づけるために開発されたことをCHRO MATIN のP roteomics）21。このアプローチは、濃縮されたサンプルの効率的なMSベースのプロテオミクス解析のために、クロマチン免疫沈降（チップ）、エピジェネティック研究に使用される十分に確立されたプロトコルを適応させる。我々は、入力およびMSによって対処かごとして用いるクロマチンの種類に応じて、2つの異なるプロトコルを開発した。特に：1）MNaseで消化した未定着ネイティブクロマチンのチップは、モノヌクレオソームを精製するとCO会合hPTMs（N-ChroP）を解剖するために採用されている。 2）超音波処理によって断片化、架橋クロマチンのチップは、タンパク質（X-ChroP）を結合すべての共同豊かクロマチンを特徴づけるSILACベースinteractomics戦略と組み合わせて使用​​されている。ここでは、免疫沈降ステップのための餌としてのH3K9me3を使用して、ヘテロクロマチンを豊かにし、研究するための、N-とX-ChroPの組み合わせを示している。 ChroPの使用が拡張することができるこのようにエピジェネティクスでの様々なアプリケーションへの道を切り開いて、明確なクロマチン上の領域、または別の機能的状態への移行時に、同じ領域内のクロマチン組成の変化のどちらかを研究する。

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プロトコル

1。細胞培養

  1. ネイティブチップ用の標準培地
    1. 10％ウシ胎児血清（FBS）、1％グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mM HEPES（pH7.5）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を成長させる。
  2. チップ架橋するSILACラベリング
    1. 10％透析FBS、1％グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMのHEPES pH7.5および光L-リジン（Lysで0）、L-のいずれかを補充したリジンおよびアルギニンの枯渇したSILAC DMEM培地中にHeLa細胞を、成長アルギニン（Arg 0）またはその重対応物、L-リジン（Lysで8）およびL-アルギニン（Arg 10）（ 材料表）をそれぞれ73ミリグラム/ Lおよび42 mg / Lでの最終濃度。
    2. 完全な同位体コードアミノ酸の取り込みを確実にするためにSILAC培地で最大8つの世代のために細胞を増殖させる。彼らは交流でそれらを播種し、1.0〜1.5×10 6細胞/ mlの密度に達したとき、2日ごとに細胞を通過3×10 5細胞/ mlのoncentration。
    3. SILAC培地の悪い組成物から生じ得る生理学からの任意の可能な変化を個別化するためにSILAC培地中の細胞増殖および生存度を評価する;これを行うには：
      1. 視覚的にラベル付けの際には毎日顕微鏡で細胞の形態を検査します。
      2. 標準培地に対してSILAC中で増殖する細胞の細胞やプロット成長曲線を数える。

2。ネイティブクロマチン免疫沈降（N-チップ）

  1. 培養細胞からの核の準備
    1. 実験ごとに1〜2×10 8の非標識HeLaS3細胞を使用してください。収穫細胞は、氷冷PBSで洗っ、4℃で10分間340×gで50ミリリットル試験管や遠心機で50×10 6細胞のアリコートを作る。
    2. 8ミリリットル溶解緩衝液（ 表1）の各細胞ペレットを再懸濁し、回転ホイール上、4℃で10分間インキュベートする。 CAを注ぐ細胞質から核を分離するために、4℃で20分間3270×gでスイングアウトローターでショ糖クッション（ 表1）、遠心分離上refully各細胞溶解物、、。
    3. 、上清を廃棄し、核ペレットを維持し、遠心分離により、氷冷PBSで2回洗っ、各洗浄で上清を捨てる。
  2. ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）消化（小規模）及び消化後のクロマチンの品質管理
    1. 1ミリリットル消化緩衝液（ 表1）中で洗浄し、核ペレットを再懸濁; 500μLの2アリコートで分割し、氷上に保つ。
    2. 0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中で1:200に希釈し、アリコートの260nmでの光学密度（OD）を測定注 ：OD = 1は、クロマチンDNAの約50μg/ mlに相当する。典型的に、2×10 8細胞から出発して、ODは40〜60の範囲である。
    3. 核の1％を取る0の最終濃度までMNase酵素を加える。核の酵素/μlに005 U及び異なる時間経過（0、10、20、40、60分）、37℃でインキュベートする。
    4. 各時点で、消化された核の4μLを収集し、MNase反応を停止させ、1mMのEDTAを加える。氷の上においてください。
    5. PCR精製キットでDNAサンプルを抽出し、50μlのTEバッファー（ 表1）でそれらを溶出する。
    6. 各DNAサンプルを20μlを取るバッファ（ 表1）をロード10μLを追加し、1％のサンプルをロード（w / v）のサイズ制御などのPCRマーカーでエチジウムブロマイドを含むアガロースゲル。
    7. MNaseのインキュベーションによって生成クロマチン、ヌクレオソームはしごを評価し、消化を確認してください。
    8. 準備中のモノヌクレオソームの有病率に基づいて、消化のための最適な時間を選択してください。通常は0.005ための核の酵素/μLのUはMNase消化の最適な時間は60分（ 図1B、左パネル ）であることに注意してください。digestiの最適MNaseの濃度/時間上で所望の細胞型に延伸し、ヌクレオソームの大きさに応じて調整することができる。
  3. Large-scale/preparative MNase消化と可溶性クロマチン分画の回収
    1. 各アリコートに追加核の酵素/μLの0.005 Uの最終濃度に対応し、5μlのMNase（2.2.1を参照）。穏やかに混合し、（小規模試験に基づいて、最適化された時間間隔の間、または一般に）60分間37℃でインキュベートする。
    2. 反応を停止し、氷上に保つために1 mMのEDTAを追加します。 10分間4℃で7,800×gの遠心分離によって消化核をペレット化。新しいチューブに上清（フラクションS1）を転送し、4℃で保存注：S1はモノヌクレオソームを構成するクロマチンの最初の可溶性画分を含んでいます。プロテアーゼ阻害剤（ 表1）を追加します。
    3. 丁寧に1ミリリットル透析バッファー（ 表1）中のペレットを再懸濁し、4℃（で一晩透析透析チューブのオフUTは一定の穏やかな攪拌しながら、3リットルの透析緩衝液中で、3.5 kDa）のである。 4℃で10分間7800×gで透析した物質や遠心分離機を収集新しいエッペンドルフチューブに上清（S2分）を転送し、4℃で保存注意：S2含むMNase消化の程度に応じてエプタ-ヌクレオソーム、ジ-へ。
  4. 免疫沈降前のクロマチンの品質管理
    1. （ナノドロップシステムにおいて260nmでODを測定することによって定量）S1とS2クロマチン画分の5μgのに対応するアリコートを取る。 PCR精製キットでDNAを抽出し、50μlのTEバッファー（ 表1）で溶出する。
    2. S1とS2のDNAを20μlを取るバッファ（ 表1）をロードする 10μLと混合し、（w / v）アガロースゲル1％にそれらをロードします。ヌクレオソームラダーの目視検査によりMNase消化の質と効率をチェックしてください（注）。フラクションS1は非常にある端数S2は、主にポリ-ヌクレオソーム（ 図1B、右パネル ）が含まれていますが、モノヌクレオソームが濃縮された。
  5. 抗体とクロマチンのインキュベーション
    1. -20℃、その後の質量分析のためのS1画分の50μLで保存。
    2. 分数S1、チップ希釈バッファー（ 表1）の1ボリュームを追加します。
    3. 興味のあるhPTM（またはタンパク質）に対する抗体を追加します。 4℃（注）で回転ホイール上で一晩インキュベートする：通常、2×10 8細胞に対する抗体の20マイクログラムを10μgを使用しています。抗体の量と開始細胞数との最適な比率を慎重にサンプル内の餌として使用hPTM /タンパク質の量で、抗体の効率に応じて、ケースバイケースで設定しなければなりません。最適化は、次のテストに基づいて、実験的なものです：
      1. 入力およびフロースルー（FT間の利益hPTM /タンパク質の量を比較して、免疫沈降は、特定のクロマチン領域のかなりの割合を豊かにあることを確認するために、ウエスタンブロットまたはMSによって2.7.2）を参照してください（注）。hPTM /タンパク質ベイトの少なくとも50％が、FT（ 図1C）でなくなった時点で、これは一般的に達成されている。
      2. 興味のある免疫沈降タンパク質は十分な量の材料がMS分析に利用可能であることを保証し、SDS-PAGEゲル上で検出可能であることを確認してください注：正しい化学量論で4コアヒストンに対応するバンドのゲル上で存在感を無傷のヌクレオソームは、N-ChroP（ 図1D）によって免疫沈降されたことを示します。適切な化学量論の欠如は、部分的な中断/展開ヌクレオソームのを示す事実である。
    4. 並行して、プロテインG結合磁性ビーズ（2.6参照）を準備する。
  6. プロテインG結合磁性ビーズの平衡化とブロッキング
    1. プロテインG結合磁性ビーズを100μlを平衡3回洗浄し、回転ホイール上で4℃で一晩インキュベートすること、ソリューション（ 表1）をブロック内のスラリー（注）。ビーズの結合能力に続いて、スラリーの100μlを使用する抗体の2月20日μgの。
    2. ChIPの希釈バッファー（ 表1）で2回、次にブロッキング溶液で1回ブロックしたビーズを洗浄します。
  7. 磁気ビーズを用いたクロマチンの単離
    1. S1はクロマチンサンプルにブロックされたビーズを100μlを加え、3時間、4℃で回転ホイール上でそれらをインキュベートする。先端の蓋からサンプルをスピンダウンする1分間340×gで遠心分離する。ビーズをペレット化し、磁気ラックに置く。
    2. 新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移します。これは（FT）を通る流れは、抗体に結合しなかったクロマチン、すなわち割合である。
    3. ビーズ4を洗う各洗浄（75、125と175のNaCl）で塩濃度を増加バッファー（ 表1）洗浄のタイムズ。
    4. 免疫沈降したクロマチンを溶出させ、70℃で5分間、50mMのジチオスレイトール（DTT）を補充したLDSサンプル緩衝液30μlを、ビーズをインキュベートする4〜12％ビス-トリスアクリルアミドSDS-PAGEプレキャスト勾配ゲル上で溶出したタンパク質を分離し、コロイド状クマシー染色キット（ 図1D）を用いてゲルを染色する。

3。架橋クロマチン免疫沈降（X-チップ）

  1. ホルムアルデヒドを用いた細胞の架橋
    1. 手短に混合し、室温で10分間インキュベートし、SILAC標識した細胞を0.75％ホルムアルデヒドを加える。 125mMのグリシンを添加することによりホルムアルデヒドをクエンチし、室温で5分間インキュベートする。
    2. 5×10 7アリコートで細胞を分ける。 430で遠心分離することにより、それらを氷冷PBSで3回すすぎ4℃で5分間×gで、各洗浄後に上清を廃棄する。最後の洗浄では、上清を捨て、ペレットを保持します。注：細胞は、架橋されたらすぐに使用しない場合、それらは、-80℃で保存することができる。
  2. 核の準備
    1. 10ミリリットル溶解バッファー（ 表1）における各細胞ペレットを再懸濁する。回転させながら4℃で10分間インキュベートする。 4℃で5分間430×gで遠心分離上清を捨てる。核ペレットを保つ。
    2. バッファ（ 表1）洗浄の10ミリリットルの各核ペレットを再懸濁します。回転ホイール上で10分間室温でインキュベートする。
    3. 4℃で5分間430×gで遠心分離上清を捨て、ペレットを収集します。
    4. 3ミリリットルのChIPインキュベーションバッファー（ 表1）に、各核ペレットを再懸濁します。氷の上においてください。
  3. クロマチン超音波処理と品質管理
    1. 超音波処理CH200 Wを冷却Bioruptorで（「オフ」、1分間の「オン」30秒のサイクル）、クロマチンを断片化するための少なくともromatin 注サイクルおよび超音波処理の間隔の数は、細胞の種類およびヌクレオソームの平均の長さに依存する希望を伸ばす。典型的には、超音波処理の30分はジ - 及びトリ - ヌクレオソームに対応する、長さ300〜500塩基対のDNA断片を生成するために必要である。フラグメント·サイズの選択は、調査中のクロマチンドメインの種類によって異なります。
    2. ChIPのインキュベーションバッファー中で1時間の最低65℃でインキュベートすることにより、架橋を逆転させる、全入力の2％を取る。 PCR精製キットでDNAを抽出し、50μlのTE緩衝液に溶出し、クロマチンの断片化を確認するために、アガロースゲル上のDNAをロードします。
  4. 抗体とクロマチンのインキュベーション
    1. クロマチンを超音波処理し、10％トリトンX-100、1/10量を追加します。ペレットにし、4℃で10分間12,000 xgで遠心デのBRI。
    2. 標識された細胞にSILACアミノ酸の取り込みレベルをテストするためとタンパク質プロファイリングのために重い細胞からクロマチンの入力を50μlを保存します。
    3. 残りの重鎖と軽ラベル、超音波処理したクロマチンに選択抗体を追加し、回転ホイール上で4℃で一晩インキュベートする。光チャンネルでは、可溶性ペプチドの過剰倍を追加します。回転ホイール上で4℃で一晩インキュベート注 2.5.3で説明したように、抗体のμgの細胞の出発物質との間の最適な条件は、ケースバイケースで選択されます。抗体に関して中の可溶性ペプチドの最適な過剰倍のモル濃度は慎重にケースバイケースで滴定する必要があります。
  5. 磁気ビーズを用いたクロマチンの単離
    1. 2.6で説明した手順に従い、ChIPのインキュベーション緩衝液を用いることにより、プロテインG結合磁性ビーズを平衡化し、ブロックします。
    2. ブロックされたBを100μlを追加クロマチンサンプルにEADS、4℃で3時間、回転ホイール上でインキュベート先端の蓋からサンプルをスピンダウンする1分間340×gで遠心分離する。ビーズをペレット化し、磁気ラックに置く。上清を結合していないヌクレオソームを含む、（FT）を通る流れである。洗浄は増加する塩濃度（二150mMの少なくとも洗浄および300mMのNaCl二つの）を用いて緩衝液（ 表1）洗浄4回ビーズ。
    3. 溶出し、脱架橋免疫沈降したタンパク質の両方を95℃で30μlのSDS-PAGEローディングサンプルバッファー（ 表1）にし、25分間ビーズをインキュベートする。 4〜12％ビス-トリスアクリルアミドSDS-PAGEプレキャストゲル（ 図3D）に別々のタンパク質。

以前はMSへ4。サンプル調製

  1. ゲル内のN-チップからの豊富なヒストンの消化
    注意：タンパク質消化とペプチド抽出工程中に世話をする以前に22、23を説明するように、LC-MS/MSと干渉ケラチン汚染を最小限に抑えます。
    1. 切断ゲルスライスをコアヒストン帯域（ 図1D）に対応する。ゲルを縮小するために100％のACNで交互に、のddH 2 O中50％アセトニトリル（ACN）でゲル片を脱染色する。ゲル片が完全に脱染色し、真空遠心でそれらを乾燥するまで繰り返します。
    2. 触媒として、1 M重炭酸アンモニウム（NH 4 HCO 3）（典型的には、最終的な体積が60〜100μlである）及び3μlの酢酸ナトリウム（CH 3 COONa）の中で（v / v）のD 6-無水酢酸1:9入れる。強力振とうしながら37℃で3時間インキュベート注 ：サンプルは、反応を組み立てた後、非常に最初の数分で気泡を生成することがあります：それは重要な注意して処理し、発生したガスを放出するために、時々口チューブインキュベーション中。
    3. wは、ゲル片を数回すすぎi番目のNH 4 HCO 3、完全にD 6-無水酢酸の残留物を除去するために増加する割合（50％〜100％）でのACNと交互。
    4. 100％ACN中ゲル片を縮小;完全な脱水和を確実にするために真空遠心でそれらを乾燥させます。 50mMのNH 4 HCO 3中の氷冷100 NG /μLトリプシン溶液で再水和物ゲル片、37℃（注）で一晩インキュベート：重水素化無水酢酸およびトリプシン消化を用いてリシンの化学修飾の組み合わせ」のArgを生成し、ヒストン21,24のゲル消化パターンの「Cのよう。
    5. 過剰の溶液を捨て、完全にゲル片をカバーする50のNH 4 HCO 3の量を追加します。 37℃で一晩インキュベートする。
    6. 新しいエッペンドルフチュー​​ブに可溶で消化されたペプチドを収集します。ペプチドを凍結乾燥。 0.5％酢酸acid/0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）で再懸濁します。脱塩および集中逆相手作りのマイクロカラム上のC 18 /カーボン「サンドイッチ」とイオン交換クロマトグラフィー（SCX）（StageTip）25に対するペプチド。
    7. 200μlのヒントに固定化されたC 18 /カーボン（「サンドイッチ」）し、SCXビーズを含有するテフロン網ディスクを入れてStageTipのマイクロカラムを準備します。カーボンフィルターを搭載し第二の先端の上に、C 18マイクロカラムをロードすることによって、「サンドイッチ」を得る注意：C 18フィルター上に保持されていない非常に短いペプチドを、直接にロードされているフロースルーを渡し通常、それらをキャプチャカーボンヒント、。 SCX StageTipsは、効率的に、逆相クロマトグラフィーによって保持されていないH3（3-8）ペプチド、などの特定のペプチドを豊かにすることができます。
    8. SCX StageTipsへのC 18 /炭素」サンドイッチStageTip」と50パーセントにロードペプチドの50％。 80％ACN/0.5％の酢酸ACを使用してC 18 /カーボンのヒントからそれらを溶出5％水酸化アンモニウム（NH 4 OH）/ 30％メタノールでSCX idとヒントから。凍結乾燥後、0.1％FAに再懸濁し、ペプチドおよびLC-MS/MSにより分析する。
  2. 免疫精製タンパク質のゲル内消化
    タンパク質のゲル内消化は、軽微な変更を加えて、以前に記載22のように行われる。
    1. 10スライス（ 図3D）の各レーンと1ミリメートル3の小さな立方体の各スライスを切った。 50のNH 4 HCO 3/50％エタノールでゲル片を脱染色およびゲルを縮小するために、無水エタノールを加える。ゲルが完全に脱色されるまで繰り返します。
    2. 暗所で、室温で45分間アルキル化緩衝液（ 表1）を加え、続いて56℃で1時間、のためのゲル片に還元緩衝液（ 表1）を追加します。真空遠心でゲル片を洗浄し、乾燥させます。
    3. 氷のように冷たい12.5 NG /μLトリプシンゾルとゲル片を再水和50 mMのNH 4 HCO 3中ution、ゲル片を完全に再水和するまで氷上でインキュベートする。過剰にトリプシンを除去します。
    4. 完全にゲル片をカバーする50のNH 4 HCO 3を追加します。 37℃で一晩インキュベートする。
    5. 液体部分を収集します。ゲル片に抽出バッファー（ 表1）を追加します。室温で10分間強く攪拌しながらインキュベートする。二回繰り返します。
    6. 強力に撹拌しながら10分間のACNでゲル片をインキュベートする。二回繰り返して、すべての上清をプールする。
    7. ペプチドを凍結乾燥。 0.5％酢酸acid/0.1％のTFA中で乾燥したペプチドを再懸濁します。
    8. 脱塩及び26,27記載のように、逆相C 18 StageTipにペプチドを濃縮する。
    9. 80％ACN/0.5％の酢酸を用いてC 18 StageTipからペプチドを溶出させる。真空遠心分離で蒸発させることにより、有機溶媒を除去し、0.1％のFAでのペプチドを再懸濁（通常5〜10＆＃181; L）において、MS分析する準備が整いました。

5。LC-MS分析

  1. 液体クロマトグラフ分析
    1. 使用して一定のヘリウム圧力（50バール）での逆相（RP）は、C 18、メタノール中で3μmの樹脂を使用して、15センチメートル溶融シリカエミッター（75μmの内径、350μmの外径）での分析カラムを詰める爆弾ローダデバイス、以前に説明したように28。
    2. カップル20センチ、長を通じて直接、HPLCの6ポートバルブの出口に詰まっエミッタ（C 18 RPカラム）（25μmの内径）プレカラムまたは分割装置を用いることなく溶融シリカ。
    3. 500 NL /分移動相A（0.1％FA / 5％のddH 2 O中のACN）の流れで、C 18 RPカラム内消化されたペプチドをロードします。
    4. 試料負荷後、以下の勾配を使用してペプチドを分離。
      1. 適用する0〜40％移動相B（0.1％FA/99％ACN250 NL /分でのddH 2 O）でヒストンに由来するペプチドの溶出に5分かけて10分60〜80％、で40から60パーセントの勾配が続く90分（2）を参照してください。
      2. （3を参照）免疫精製タンパク質に由来するペプチドの溶出のために、5分かけて10分60〜80％において36〜60%の勾配が続く120分かけて250 NL /分で0から36パーセント移動相Bを適用します。
  2. LTQ-FT-ICR-ウルトラ質量分析計を用いて質量分析解析
    1. 自動的にMSとMSMS収集を切り替えるデータ依存収集（DDA）モードで動作します。フルスキャンMSスペクトルは、典型的には200-1,650からm / z範囲内に、取得さ400のm / zにおいて解像度R = 100,000で取得される。 5（TOP5）最も強いイオンが5000の目標値で衝突誘起解離（CID）を用いて、線形イオントラップにおいてフラグメント化のために単離される。
    2. 表2 FOにリストされているパラメータを使用して、R「チューニング」の取得ファイル。
    3. 表2に記載されている標準的な取得の設定を行う。

6。データ解析

  1. クロマチンドメインでのCOに富むヒストン修飾の自由な定量化にラベルを付ける
    1. 取得した生ファイルはRaw2msmソフトウェア（バージョン1.10）29を使用して、MGFファイルに変換します。
    2. 表3に記載したパラメータを設定し、マスコットディーモン（バージョン2.2.2）を使用して、ヒストン修飾を検索します。
    3. マスコット出力ペプチドリストに、15よりも低いスコアを持つ以上または5の推定PTMは29を有するペプチドを削除注：各単一ペプチドIDごとに、最高のマスコットスコアを有するペプチドを選択し、同じIDを持つすべての他の冗長性ペプチドをフィルタ。
    4. BAS、すべての修飾ペプチドに対応するそれぞれの前駆体のための抽出イオンクロマトグラム（XIC）を構築QualBrowserを用いて、m / z値に編。各ピーク（ 図2A）の曲線下面積（AUC）を計算します。
    5. QualBrowser（ 図2B）を用いてMS / MSスペクトルの目視検査によって修飾を含む各同定されたペプチドを検証する。
    6. 変更された各ペプチドの相対存在量を計算する。のChIP-ED材料における各変更の相対的濃縮を計算します（注）。相対的な存在量は同じペプチドの全ての修飾および非修飾形態のAUCの合計以上のそれぞれの特定の改変されたペプチドのAUCの比として計算され、一方、相対的入力（ 図2C）の上のチップに特異的な修飾の相対存在量の比として濃縮。
  2. タンパク質の定量的なプロテオーム解析クロマチンドメイン内で共関連する
    1. タンパク質の同定および定量のためにMaxQuantパッケージを使用（のhttp://www。maxquant.org /）30。 AndromedaConfig.exe 31を使用して、組み込みの検索エンジン「アンドロメダ」を設定し、 表3にリストされている検索パラメータを設定します。
  3. 取り込みテスト
    1. 以下のように、MaxQuantソフトウェアを使用して、重ラベルされたクロマチン入力内のタンパク質に重いアミノ酸の取り込みの程度を推定する。
      1. 6.2で説明したが、再定量化オプションを無効にするようにパラメータを設定します。
      2. 取り込み非冗長ペプチド比に次の式を適用する割合計算します。 取り込み（％）=比（H / L）/比（H / L）+ 1×100（ 図3B）注：受け入れた場合にのみ取り込み> 95 ％。

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結果

クロマチン免疫沈降は、ゲノムに沿って、タンパク質やヒストン修飾の局在をプロファイルするために使用される強力な手法です。プロテオミクスと同等で、チップは、目的の変更またはタンパク質と一緒に免疫沈降「餌」として使用される質的にも量的にhPTMs、ヒストン変異体およびクロマチン結合タンパク質を同定するために、MSベースのプロテオミクスが続いている。 図1A?...

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ディスカッション

我々は最近ChroP、クロマチンのタンパク質成分の大規模な特性評価のための定量的な戦略を記載している。 ChroPは、その強度から利益とそれぞれの限界を克服し、エピジェネティックなフィールドは、チップとMSで使用される2つの相補的なアプローチを組み合わせています。深いシーケンシング（チップ配列）に結合されたチップは、数ヌクレオソーム35の解像度でヒストン修飾のゲ?...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

この研究は、もともとモル細胞プロテオミクスに掲載されました。 soldoの複数形M.およびクロマチン機能ドメインのBonaldi T.ザ·プロテオミクス研究は、異なるヘテロクロマチンコンポーネントのMCPの中で小説相乗作用を明らかにしている。 2013; 12：64-80。 ©生化学分子生物学のためのアメリカの社会。私たちは、原稿の重要な読書のためのロベルタNoberini（技術とIEOのイタリアの研究所、イタリア）に感謝。結核作業はジョバンニArmenise ​​ - ハーバード財団キャリア開発プログラム、がん研究のためのイタリアの協会と厚生労働省のイタリアからの補助金によってサポートされています。 MSの作業はFIRCフェローシップによってサポートされていました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

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