Nanopodia - 細胞運動および細胞間の相互作用において役割を有する薄い、壊れやすい膜見通し

要約

Nanopodiaは、セルの前面を先頭または末尾に背面から100ミクロンにまで拡張し、細胞環境を感知薄いが脆弱な膜チャネルである。 37℃で、穏やかに洗浄し、エタノール、メタノール、アセトン等の有機溶媒の回避でより高いトリトンX-100の濃度の直接的な固定は、これらの細胞構造を観察するために必要とされる。

要約

培養液中の接着細胞は、移動や細胞間の相互作用をサポートするために、偏光状態を維持している。 Nanopodiaは、薄く細長い、TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）免疫蛍光染色によって可視化することができる内皮細胞および癌細胞中の大部分は、F-アクチン負の膜突起で。 100から300ミクロン径TMEDにおけるTM4SF1クラスターのような多くの14のような個々のTM4SF1の分子に3を含む（TM 4SF1 eはマイクロd omainsをnriched。） TMEDは、μメートル当たり1から3 TMEDの規則的な間隔でnanopodiaに沿って断続的に配置されており、しっかりと行列にnanopodiaを固定している。これは、偏内皮細胞または腫瘍細胞の前を先頭または末尾に背面から100以上のμメートルを拡張することnanopodiaが可能となり、MATRに残されるべき膜残基を引き起こすIXの細胞が離れて移動したとき。 TMEDとnanopodiaは、それらの極端な脆弱性および温度に対する感受性見過ごされてきた。ルーチンの洗浄と固定が構造を破壊する。 Nanopodia、染色の前に、0.01％トリトンX-100に短時間曝露し、続いて37℃でパラホルムアルデヒド（PFA）中に直接固定することによって保存される。細胞生物学における新しい展望を開くNanopodia：彼らは検出して距離をおいて他の細胞を識別し、密接な接触で細胞間の相互作用を開始し、移動、増殖に関与するシグナル伝達機構のため、細胞がその環境を感知する方法の理解を再構築し、細胞を約束する - 細胞コミュニケーション。 TM4SF1由来nanopodiaを研究するために開発されている方法は、古典的なテトラスパニン、特に普遍的に発現CD9、CD81、およびCD151の代理店を通じて他の細胞型に形成nanopodiaの研究のために有用である可能性がある。

概要

移動用の偏光の間に、動物細胞は糸状仮足、ラメリポディア、後退繊維、フリル¹を含め、それらの表面から動的、膜突起、さまざまな拡張。最近、このリストに追加さnanopodia、薄いの新しく認識されたタイプ（直径100〜300μmの）、などの糸状仮足のようなF-アクチンの構造の拡張のための膜チャネルを提供する細長い（最大50〜100ミクロンの長さ）の膜突起があったと後退繊維、その汚れ積極TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）培養内皮細胞および腫瘍細胞^の2,3内で。

TM4SF1は、もともと分子が内皮細胞の増殖および遊走^2,3において必須の役割を果たし、内皮細胞バイオマーカーであるという発見の前に、腫瘍細胞抗原⁴として知られていたテトラスパニン様トポロジーを有するタンパク質である。免疫蛍光染色は、TM4SF1がperinucに局在していることを明らかにしたリア小胞と細胞膜へとは、TM 4SF1 電子 nrichedマイクロd omains（TMED）に富んでいる。 TMEDアンカー行列にnanopodiaとnanopodia 1-3 TMED /ミクロンの長さの等間隔の縞状に存在する。 Nanopodiaは、典型的には、細胞の主要なフロントから延びており、移動のための細胞極性の間にリアトレーリング。原因TMEDしっかり接着性性質のために、nanopodiaはそれが離れて移動するときに戻って、細胞内に後退することはできません。放棄nanopodia残基は、このような細胞移動経路をトレース。 F-アクチン伸縮用の膜チャネルを提供し、細胞間の相互作用や通信^2,3のサイトがあるNanopodia。これらの特性は、細胞の偏光、環境の細胞センシング、細胞運動のパスと方向の決定、および細胞間の相互作用の間、F-アクチンアセンブリのメカニズムを研究するユニークな機会を提供nanopodiaことを意味ND通信。

原因TMEDの高度に疎水性の性質とnanopodiaの薄くて壊れやすい膜状性質のために、特別な注意はTMEDとnanopodiaを維持するために注意が必要です。 nanopodiaおよび一般的な実験方法によるTMEDの除去の破壊は六十から三出版物は1986年¹年に最初の発見以来、オン、100〜300ミクロンのマイクロドメインにおけるTM4SF1濃縮の知識の完全な欠如のためにTM4SF1に登場してきた理由の可能な理由である細胞表面2009 ²での内皮細胞におけるTM4SF1のレポートまでです。

従来の免疫染色法が一般的に細胞を固定し、細胞を^5を透過性^にするために、0.1％以上のトリトンX-100の濃度を使用するために、エタノール、メタノール、アセトンなどの有機溶剤を使用しています。 （I）37℃、4％PFAを使用すると、37に細胞を固定：ここに記載された研究は、TMEDとnanopodiaを明らかにし、従来の方法に3の主要な変更を実施76、Cインキュベーターは、（ii）は、穏やかに室温PBS洗浄を適用し、（iii）のトリトンX-100トリトンX-100 0.03％以上抽出するように、一次抗体を添加する前に細胞を透過するだけで簡単に0.03％未満を使用TM4SF1。

すべてのテトラスパニンは細胞膜⁶上のマイクロドメインを形成し、いくつかは、内皮細胞および腫瘍細胞^の2,3にTMEDと共局在。 CD9、CD81、およびCD151などテトラスパニンが遍在的に発現されるように、ここに記載の染色プロトコルはnanopodia機能の研究のためにTM4SF1を欠いている多くの異なる細胞型に拡張することができる。

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プロトコル

1。コラーゲンコーティングされたガラスディスク上の細胞培養

1. ガラスの瓶（4オンス）やディスクを滅菌するオートクレーブ内の場所のガラスディスク（直径12ミリメートル）。
2. 50ミリリットルファルコンチューブに25ミリリットルの70％エタノールを入れ、細胞培養フードに入れてください。溶液のレベルが20mlに低下するまでこの溶液を複数回再利用することができる。
3. ガラスディスクを処理するためにそれを使用する前に、5分間、70％エタノールに余分な細かい点でシャープな鉗子を配置します。
4. 慎重にチューブから鉗子を外し、キャップを閉め、ゆっくり2分間空気乾燥チューブの上にエタノール治療ピンセットを置く。鉗子の先端がフード内には何も触れないようにしてください。
5. ガラスの瓶のうちの一方の滅菌ガラスディスクを取得し、24ウェル細胞培養プレートのウェルに入れて滅菌ピンセットを使用する。井戸の所望の数のディスクが読み込まれるまで繰り返します。
6. （ウシコラーゲン溶液500μlを入れて50 ng / mlの）ガラスディスクを含有し、少なくとも30分間、37℃、5％CO ₂細胞培養インキュベーターに置き、各ウェルに。長いインキュベーションには害はありません。
7. 収穫HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、またはPC3既にトリプシン処理を介して150ミリメートル細胞培養プレート中で増殖させ、その完全な培地を用いてトリプシン活性をブロックした（前立腺腫瘍細胞）。 15ミリリットルのファルコンチューブに細胞を回収します。
8. 細胞数をカウントし、生存率が90％以上であることを確認してください。
9. 4℃で10分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット上清を取り除きます。
10. 10 ⁵細胞/ mlに細胞を希釈し、培養培地を使用する。氷の上にセルを配置します。
11. 細胞培養フード内でコラーゲンを吸引し、そっとガラスディスクがコラーゲンでプレコートされた各ウェルに細胞懸濁液を500μlを置く。 24ウェルプレート中5×10 ⁴細胞/ウェルを60％のconfにを与えるHUVEC及びPC3細胞を、30％コンフルエントのためluency。注：より高い細胞密度の細胞懸濁液を加える。
12. 培養37°C、1時間、2時間、4時間、6時間、又はnanopodia活性および細胞の通過を追跡する24時間、5％CO ₂インキュベーター内で細胞が挙げられる。一般的に、細胞は最初の30分でガラスディスクに付着すると、分極と最初の一時間に移行し始めて、次の時間に細胞間相互作用や細胞分裂を行う。

2。細胞固定

1. 各ウェルには、細胞を固定するために500μlの4％PFA（パラホルムアルデヒド）が必要になります。商業的に製造された又は新たに4％PFAを用いることができるいずれかからなる。準備井戸の数に基づいて、必要とされるPFAの量を計算し、15 mlのファルコンチューブにPFAを置く。注意：ホルムアルデヒドは、疑いのある発がん性物質である。
2. 37℃のインキュベーター内で所定の位置に既にあったスタイロフォームスタンドでファルコンチューブを置く。戦争30分間インキュベーター内チューブを残し37℃にPFAをメートル
3. 培養フードに加熱パッドを配置し、電源を入れます。
4. 24ウェル細胞培養プレートと培養器から温めておいたPFAを取り出し、加熱パッドの上に置きます。
5. 井戸から培地を吸引し、直後に優しく良くエッジを通じてウェルに500μlのPFAをスライドさせるもう一方の手を使って片手で行ってください。それがその角度で安定するように簡単に吸引のために、発泡スチロールの台に対してそれをもたれ、約45℃で培養プレートを傾けます。これは、吸引を容易にし、培養中の細胞を乱すことなくウェルにPFA溶液を添加することであろう。これは、細胞の活動の元の細胞構造を維持するための最も重要なステップである。
6. ガラスディスクを持つすべてのウェルがPFAを受け取るまでプロセスを繰り返します。注：井戸から既存のソリューションを変更するために必要なすべてのステップは同じ吸引手順を適用します。
7. 5分間、37℃でプレートを置きます。
8. バック培養フードにプレートを取り、ステップ2.5で説明したように発泡スチロールに対して傾ける。優しくコレクションチューブに井戸からPFAを転送するために片手を使用。直後だけでなく、少なくとも500μlの室温PBSを配置するためにもう一方の手を使用しています。全てのウェルを洗浄した後、戻ってよく、すべての中でもう一度PBS洗浄を繰り返します。有害廃棄物容器に集められたPFAを空にします。
9. ICCは、PBS、2％ウシ胎児血清を添加することによりブロッキング緩衝液調製する。 0.04％アジ化ナトリウムを、（20％ストック溶液から希釈）を防腐剤として添加される。注意：アジ化ナトリウムは、毒性化合物である。緩衝液は、細菌汚染のない長期間4℃で保存することができる。
10. それでも各ウェルのPBSを除去して吸引し、その直後に、ICCのブロッキング緩衝液500μlを加えることによって、サイクルが再び、スタンドに対して傾いた培養プレートで。セルは現在、免疫蛍光染色のための準備が整いました。必要に応じて、固定した細胞はTM4SF1タンパク質の有意な損失なし週間、4℃の冷蔵庫に保存することができる。

3。 NanopodiaのTM4SF1免疫蛍光染色

1. 各ウェルに、トリトンX-100 0.01％を含む新しいブロッキングバッファーで500μlのICCブロッキングバッファーを交換し、それを1時間室温で放置します。それが細胞膜からTM4SF1が削除されますように、0.03％トリトンX-100よりも高く、使用しないでください。染色はすぐに開始する準備ができている場合にはPBSをステップ2.10から細胞を洗浄し、直接トリトンを含むブロッキングバッファーに移動することができます。
2. ICCブロッキング緩衝液中0.5μgの/ mlになるように一次抗TM4SF1（または抗CD9）抗体を希釈する。
3. 各ウェルに、ICC/0.01％トリトン緩衝液を除去し、抗TM4SF1抗体液を300μlと交換してください。室温で2時間インキュベートするか、4℃で一晩残し
4. 劣らず500よりμLのPBSで各ウェルを洗ってください。 3回繰り返します。毎回ルに与えるインキュベーション時間のastの5分。
5. 二次抗体およびファロイジン溶液を調製ICCのAlexa 488標識したロバ抗マウス二次抗体（2μg/ mlの最終濃度）の1000倍希釈およびファロイジン1,000×希釈（50 ng / mlの最終濃度）を用いて、ブロッキング緩衝液。
6. PBSを削除し、各ウェルに二次抗体とファロイジン溶液を300μLを加え、2時間インキュベートまたは4℃で一晩にしておく
7. 洗浄あたり少なくとも5分間のインキュベーションを含むPBS洗浄手順を繰り返します。最後の洗浄では、1時間PBS中で各ウェルを残す。
8. スライドガラス上の退色防止封入剤の一滴（〜10μl）をドロップします。
9. 曲げ硬い表面を軽く押して、注射針19のG 1.5 90°の先端。曲がった針を保持し、ゆっくりと井戸からガラスディスクを持ち上げ、シャープな鉗子を使用して、ディスクを把握するもう一方の手を使って片手で行ってください。
10. ガラスディスクを回し＆＃160;スライドガラス上の細胞側接点封入剤をさせる下向きにセットしてください。穏やかにガラスディスクを配置し、室温で暗所で一晩乾燥させてみましょう。
11. イメージに免疫蛍光染色nanopodiaを続行するか、-20℃でスライドボックスでスライドを保存するスライドは、-20℃の中で数ヶ月閲覧可能のままになります

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結果

ステップ1：

（例えば、HUVEC、およびこの研究で使用PC3等）、細胞が正常に成長することができるならば、細胞は播種後、30分以内にコラーゲン被覆ディスクに付着分極と程なく移動となり、先にそれらの経路のnanopodiaを拡張する運動の。 図1Aおよび1Bは、それぞれ偏光と増殖しているHUVEC。 図2（a）は、携帯状態で偏PC3細胞展覧。

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ディスカッション

NanopodiaはしっかりTMEDを通して、マトリックスに付着して、環境を感知し、細胞間の相互作用^2,3を仲介する偏モバイル携帯から100μm以上を拡張することができ、薄い細胞膜チャネルである。 Nanopodiaセルが（ 図1および図2）離れるにつれて残基が残されるように強固に接着マトリックス。 Nanopodiaは、このように私たちは、細胞がその環境を感知する方法の研究...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer