マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

要約

げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。

要約

げっ歯類の網膜は、おそらく中枢神経系（CNS）内の神経血管の相互作用を調査するためにここで最もアクセスしやすい哺乳動物系である。これは、ますます認識されているように、アルツハイマー病、多発性硬化症、および血管妥協の筋萎縮性側索硬化症などのいくつかの要素が存在する神経変性疾患。また、小児および労働年齢人口（未熟児及び糖尿病性網膜症の網膜症、それぞれ）の失明の最も顕著な原因は、生理的な血管の再成長の血管変性や障害によって特徴づけられる。この技術的論文の目的は、網膜におけるCNSの血管再生を研究するための詳細なプロトコルを提供することです。この方法は、虚血性損傷後の血管増殖の故障につながる分子メカニズムを解明するために用いることができる。また、健康的な血管叢を加速し、回復させる可能性のある治療法を検討することができます。調査結果はobtainedは記載されたアプローチを使用して、糖尿病又は未熟児網膜症と虚血の治療手段を提供し、場合によってはCNSの他の血管障害の利益を得ることができる。

概要

CNSの発達、神経、免疫細胞および血管を通して適切な組織灌流を確認し、感覚情報^1-5の伝送を可能にするために顕著に結合されたネットワークを確立する。不十分な組織の酸素と妥協代謝供給や血管のシステムの結果の内訳は、ますます神経変性疾患⁶の病因に重要な貢献者として認識されている。血管ドロップアウトし、脳内の神経血管装置の劣化は、例えば、血管性認知症、脳⁷の白質の血管病変や動脈および小血管⁸の狭窄症、アルツハイマー病と関連している。さらに、障害、血管バリア機能⁹は、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症¹⁰寄与すると考えられる。

まばゆいばかりの、このプロトコルで説明網膜モデルに直接関係の糖尿病性網膜症、未熟児¹¹と¹²の網膜症などの疾患は^、13早期血管変性の位相によって特徴付けられる。神経血管網膜上のその後の虚血性ストレスは、おそらく再、元に戻すの酸素とエネルギー供給^14〜16への代償性反応として開始過度および病理学的血管新生の第二段階をトリガします。疾患の進行の中心となる虚血性ストレスを克服するための魅力的な戦略は、特異的に神経網膜（ 図2および図3）の虚血区域に官能血管網を復元することである。制御血管新生反応を誘発することは直感に反するような抗VEGF類のような抗血管新生療法が適応の治療として考慮される条件として出くわすことがあります。しかし、このアプローチの有効性の証拠は、搭載されている。 ischemの例では、「生理​​的のような「増強する血管の成長ICの網膜症は、エレガントな内皮前駆細胞^17、食事、ω-3多価不飽和脂肪酸の増加、他の血管新生因子^18、骨髄前駆細胞¹⁹の注入、NADPHオキシダーゼ誘導されるアポトーシス²⁰の阻害のミュラー細胞に発現VEGF誘発性ダウンレギュレーションの阻害の導入により実証されている酸摂取^21、トリプトファンtRNA合成²²のカルボキシル末端断片、およびグリア細胞²³の保護のために、VEGFまたはFGF-2の直接投与による治療。また、我々は、虚血性網膜症でそのようなセマフォリンまたはネトリンなどの古典的な神経ガイダンスキューを調節する網膜内の健康な血管の血管再生を加速し、その結果、病的血管新生^24,25を低減することを実証した。直接的な臨床的関連性のため、前述の動物実験のいくつかは、血管の再を促進するという証拠を提供する網膜症の初期の虚血性段階の間に発生が大幅に可能性虚血性負荷の低減を通じて、視力を脅かす前網膜新生血管^{19、23、24、26を}減らすことができます。

機能的な血管の再生を刺激治療戦略を考案することは、血管生物学者のための重要な課題である。ここでは、網膜内の血管の再成長を調節する方策を探求するために、酸素誘発性網膜症（OIR）のマウスモデルを用いた実験系を記述する。 Smith らによって開発された。1994年²⁷で、このモデルは、人間の増殖性網膜症のためのプロキシとして機能し、P12まで75％のO ₂にP7の仔マウスを暴露し、その後、周囲の部屋のO ₂ -緊張します（ 図に子犬を再導入することからなる1）。このパラダイムは緩く未熟児が換気されているシナリオを模倣O ₂で。高濃度酸素への仔マウスの露出は、網膜毛細血管や微小血管の変性を誘発し、最大VO領域は48時間後（P9）に達しているが、血管閉塞（VO）の再現性のある区域は、一般的に、P12でのO ₂の終了時に評価し得O ₂ ²⁸への暴露。マウスでは、無血管のVOゾーンは自然に室内空気への再導入、最終的には、VOゾーンは完全に再血管化された（ 図2）は、次の週に渡って再生成します。 OIRを受けたマウスの室内空気への再導入は、典型的には、抗血管新生治療パラダイムの有効性を判断するために評価される前網膜血管新生（NV）（P17で最大）を引き起こす。その純粋な形では、OIRモデルは、酸素によって誘導される血管変性を評価し、破壊的な前網膜新生血管^29〜31の範囲を決定するために、高度に再現性があり、定量化可能なツールを提供しています。

CNS血管再生を調節する種々の探索的治療パラダイムは、薬理学的化合物の使用、遺伝子治療、遺伝子欠失などを含むOIRモデルを用いて調べることができる。血管の再成長に影響を与える特定のアプローチの傾向は、P12（高酸素を終了後に最大VO）およびp17（最大ネバダ州）間のウィンドウ内で段階的に評価する。病理学上のNV治療結果の評価は、迅速かつ容易に並行して決定することができ、十分にスタールら^30、31により記載されている。ここでは、薬理学的化合物、将来の治療薬、ウイルスベクターによって神経網膜内の生理的血行再建術の変調を調査するか、トランスジェニックやノックアウトマウスでの候補遺伝子の影響を研究するために、簡単なステップバイステップの手順を提供する。

プロトコル

倫理声明：すべての動物実験は、眼科と視覚研究と動物ケアのカナダの協議会での動物の使用に関するビジョンと眼科の研究のための協会（ARVO）文によって確立された動物のケアのガイドラインを遵守しています。

1。酸素誘起網膜症（OIR）

1. レコードP0と仔マウスの誕生日。
2. 十分な量範囲を確保するためのO ₂に入ると動物のすべての重みを記録します。注：P17でC57BL / 6マウスでは、体重は最大ネバダ³² 5と7.5グラムの間の範囲であるべきである。環境の一貫性を維持するためには、（遺伝的に改変されたマウス、ならびに実験的治療を受けたマウスの場合）を対照として同腹仔を使用することが推奨される。ウイルスベクターの効果を評価する際に、1は、ウイルスの親和性を考慮し、ウイルスにより配信導入遺伝子の完全な発現に十分な時間を与える必要があります。急速に発現するウイルスこのような第3 ^世代のレンチウイルス^24、25のようなベクターは^、33をお勧めします。
3. P7（C57BL / 6または所望の歪み）と5日間^27、75％のO ₂に設定した酸素室に母親の育成CD1の場所の仔マウス。環境湿度と温度は、O ₂の曝露を通じて一定に保持した。注：O ₂の中央源を備えた研究施設が理想的であり、空のO ₂のタンクの面倒な交換を制限する。トランスジェニックまたはノックアウトマウスを操作すると、その対照および実験マウスを確保することが重要である同じ系統^30、29内の遺伝的ドリフトを制限するために、同じベンダーから取得する。
4. P12で、酸素室からマウスを削除し、O _2を周囲の動物を返す。

インナー網膜に化合物を送達するため2。硝子体内注射 （WH薬理化合物または組換えタンパク質の効果を評価JA）

1. P14で、酸素2L /分（または任意の動物保護委員会が承認した麻酔薬）中の2％イソフルランでマウスを麻酔。麻酔の有効性を検証するために、連続してピンセットで尾、リア足と耳をつまむ。
2. その腹の上でマウスを置きます。
3. 面取りプルガラス針を取り付けた10μlの滅菌注射器を用いて、45°の、眼の後輪部に研究されて化合物またはビヒクル（生理食塩水）を含有する溶液1μlの最大容量の注入を行うレンズを避け、角度。注：プルガラス針は、エポキシ樹脂のドロップを使用して、注射器に取り付けられている。
4. マウスの眼に綿棒で潤滑眼軟膏（理想的には、抗生物質を含む）の低下を適用します。
5. 母親の育成に戻ってケージにマウスを返します。次いで、マウスを慎重に再まで監視されるカバーされ、完全に歩行可能。

蛍光眼底血管造影による血管灌流およびバリア機能の3。評価（整合性）

1. 酸素2L /分（または任意の動物保護委員会が承認した麻酔薬）中の2％イソフルランでマウスを麻酔。麻酔の有効性を検証するために、連続してピンセットで尾、リア足と耳をつまむ。注：再生が評価されるときには、典型的には、P17で行われる。また、搬出分析をP19とP21に血管の完全性を時間をかけて維持されるかどうかを判断する。
2. 麻酔をかけた後、マウスの重量を量る。
3. 解剖ハサミで正中腹部切開を行います。注：解剖の機器は定期的にチェックし、シャープにする必要があります。
4. 横方向にリブをカットし、鉗子を用いて胸郭を上げる。注：これは、心臓への損傷を回避するために横方向にできるだけカットする必要がある。
5. peripを除去した後心臓からheral組織、止血鉗子で下行大動脈をクランプする。
6. ゆっくりと25 Gの針を用いて、左心室にフルオレセイン - デキストランを注入する。注：血管バリア機能が検討されている場合は、容器の完全性が損なわれたときに血管から漏出するように、70 kDaのフルオレセイン - デキストランが使用される。治験責任医師は、血管をキャストしたい場合は、2のMDAフルオレセイン - デキストランが使用される。重要なステップ：1）、均質な配分を確保するために遠心フルオレセイン - デキストラン、上清を注入する、2）血管収縮を防止するために、加温しフルオレセイン - デキストラン溶液を注入し、3）その循環時間は、過剰の4分いけない。
7. 営業はさみで注射後のマウス2分の首。

4。除核と注視

注意：血管再生の速度を評価する際に、まず、P12で、さらに、P14とP17に網膜を収集します。サンプリングされた時点の数を増やす血行再建²⁴の速度をより正確に決定するためにs。

1. マウスの頭を傾け、その横に置きます。
2. 皮膚や解剖ハサミを使用して、目をカバーするまぶたを削除します。
3. アイの下に湾曲した鉗子を置き、静かに視神経が切断されるまで、それを引き出します。
4. その反対側にマウスの頭を回して、同じ手順（4.2および4.3ステップ）を行う。
5. 固定液の良好な浸透を確実にするために、30 G針を用いて眼の前房に穴を穿刺する。
6. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有するチューブに目を移し、室温で1時間固定する。
7. PFAを削除し、氷冷PBSの溶液で目を4回洗う。

5。網膜解剖

1. 冷PBSを含むペトリ皿にマウスの眼を置き、実体顕微鏡下で網膜の解剖を行う。
2. 顕微解剖SCIと眼の周囲の余分な脂肪/組織を除去ssors。
3. マイクロ解剖はさみで角膜を切り取ります。
4. 鉗子の2ペアを使用して、細かく視神経に向かって離れて周辺から強膜を剥離して廃棄します。
5. ピンセットでレンズ（角膜の下に白っぽいボール）をつまんで、アイカップからそれを抽出します。支持体として、鉗子の1ペアを使用し、他のグリップに、慎重にレンズを高め、削除してください。
6. 小さなブラシ（サイズ0）とピンセットを用いて、網膜の内側から硝子体血管を切り離します。
7. ピンセットを用いて視神経乳頭に接続硝子体血管のバンドルを削除します。
8. 移転前染色手順を開始する氷上でPBSと場所を含む2ミリリットルの微量遠心管に網膜を解剖した。

6。網膜血管染色

1. 1 mMのCaCl _2を含むPBS中の蛍光結合された-イソレクチンB4（ローダミンレクチンまたはその他）の溶液中で4℃で穏やかに振盪しながら一晩を解剖した網膜をインキュベート（2 mg / mlのイソレクチンB4液の1:100希釈を推奨）。全体染色手順の間に、アルミ箔や光から保護するために、不透明なホイルでチューブをカバーしています。
2. 次の日に、染色溶液を除去し、室温で10分間PBSで3回網膜を洗浄する。

網膜フラットマウントの7。準備

1. 顕微鏡スライド上に、光受容側ダウン網膜を転送し、4つの等しいサイズの象限に網膜を分割するために、外科用メスを使用して、4つの深い等距離放射状の切開を行う。それが動かないように切開中に、ブラシで網膜を引き締める。
2. PBSに浸した2つのブラシを使用して、慎重に象限の感光体側ダウンを平坦化し、光退色を防止するために媒体を実装する際に網膜を浸す。その後、慎重に圧力を印加し、気泡がカバースリップの下に蓄積しないことを確認することなしにマウントされ、網膜の表面にカバースリップを置く。

前に説明した³¹のような8。イメージングとVasoobliterationの定量（VO）と血管新生（NV）

1. 10Xの倍率でエピ蛍光顕微鏡を用いて固定した網膜全体の画像を撮る。
2. 写真編集ソフトウェアで網膜像を開いて、一緒にステッチ、総網膜面積、および無血管面積を測定する。領域をピクセル単位で表すことができる。
3. 総網膜領域の画素数で無血管領域の画素数で除して、VOの程度を決定。
4. ^31が説明されているように、全網膜領域の画素数で、NVの画素数で除して、NVの程度を決定。

結果

OIRモデルは広く、網膜に酸素誘発性血管変性及び虚血誘導病的な新生血管形成を研究するために使用されており、眼疾患^27、29、30のために現在用いられ、抗血管新生治療の開発に尽力してきました。このモデルを用いて得られた知見は緩く、例えば³⁰未熟児の網膜症および増殖性糖尿病網膜症などの虚血性網膜症に外挿することができる。

ここでは、血?...

ディスカッション

虚血性神経組織内に新しい健全な血管の成長を刺激するための最も効果的な方法は何ですか？それが干渉し、血管再生を天然加速させる治療的に有効である？虚血性網膜症や脳卒中などの神経の虚血性の病変では、血管の変性が低下し、神経機能^35-38に関連している。したがって、疾患の初期/即時セグメントの間に、地域微小循環を回復、早期の傷害に対抗することは有益性を実証?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945