マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

要約

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。

要約

試験管内のプロトコルでの胚性または多能性幹細胞誘導体の運命をテストすることは、必ずしもそれらのインビボの可能性を反映していない論争の成果につながっている。好ましくは、これらの細胞は、それらの明確な表現型を獲得するために適切な胚性環境に置かれるべきである。さらに、染料またはレトロウイルスベクターで細胞を標識した後、マウスでの研究をトレースする細胞系譜はまだよく開発された臓器を、初期段階のマウス胚の大部分が制限されたままである。これらの制限を克服するために、我々は、E9.5および開発の後期段階でのマウス胚の心臓の標的領域に様々な薬剤を注入するために、標準的な超音波媒介性マイクロインジェクションプロトコールを設計した。胚性外植片または胚培養したり、さらに子宮内で開発することが残されている。これらの薬剤は、蛍光染料、ウイルス、shRNAは、細胞または由来始原幹細胞を含む。私たちのアプローチは、FUの保存を可能に臓器のnction移行し、標識および/または注入された細胞の運命を監視しながら。これらの技術は、他の臓器に拡張することができ、開発の生物学の重要な生物学的な質問への回答が非常に参考になります。

概要

10年以上前に、ヒト胚性幹細胞（HuESCs）は、ヒト胚盤胞¹に由来している。それ以来、これらの細胞は、ヒト発生生物学において未だ満たされていない質問に対処する重要な研究分野の対象となっている。 HuESCsはさらに再生医療に希望を提供してきた。近年、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）が遺伝病²のモデルを提供し、患者特有の体細胞から生成されている。心臓系統³を含む種々の細胞系列に向かって胚または誘導多能性幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルにおける多くが、報告されている。分化した細胞は、しばしば免疫染色、および/ ​​またはインビトロ機能試験において 、RNAおよびタンパク質発現の表現型解析によってれる。しかし、多能性幹細胞誘導体は、それらが完全にセルを獲得するかどうかを試験するために適切な胚性環境に置かれなければならLの彼らの胚相手の運命と、彼らは、地域の合図に応答した、本物の生体内機能を再現するかどうか。組織工学は有望であるが、それはまだ胚組織^4,5の開発、生体内での適切なすべての既知および未知の手がかりを提供していません。

マウス胚を含む胚中の染料またはレトロウイルスベクターを用いた細胞標識は、心臓の開発⁶時の細胞系譜の胚起源に関して重要な情報を持ってきた。例えば、単離された心臓のin vitro培養したex vivoでのマウス胚の心膜腔への注射色素は、心外膜細胞およびその子孫^7を標識するために使用した。しかし、染料およびレトロウイルス細胞標識は、ほとんどが⁸より簡単にアクセスできますまだよく開発された臓器、またはニワトリ胚とマウス初期胚に適用されている。例外はEでターゲットしやすい脳、あるmbryos ^9,10。このようなアプローチはまだ破っ胚性マウスの心臓に適用されていない。

染料またはウイルスに直接標識を補完するために、より進行した段階のマウス胚および成体マウスにおけるトレース系統を実行するために、細胞標識法は、Cre /ロックス技術を用いて、トランスジェニックマウスの分析と組み合わされている。のCre /ロックスアプローチ^11しかしリコンビナーゼの発現を駆動するために使用するゲノム調節領域の時空間特異性、およびのCre / lox組換え¹²の効率のためにいくつかの制限を提供しています。それだけでCre発現を駆動するために使用される調節領域の活性化後に前駆体を標識することができるように、さらに、このアプローチは、完全に細胞運命の細胞移動駆動の取得の具体的な質問に対処していない。また、明らかに倫理的な問題のために、人間の胚に適用することはできません。

これらの制限を考えると、我々は新しい一連のpを設計しの標的領域にこのような蛍光色素、ウイルス、そのようなshRNAは、およびDNAベースの細胞標識ベクターとしての遺伝子発現モジュレーター、またはE9.5および開発の後期段階におけるマウス胚における細胞のような細胞標識種々の薬剤を注入するrotocols心。

DNA /細胞注入は、実体顕微鏡および48時間、または48〜72時間のために孤立した心臓や胚移植片培養までのex vivoでの胚の培養と組み合わせたシンプルなマイクロインジェクション装置を用いる。我々はまた、 子宮内マウス胎児心超音波媒介マイクロインジェクションプロトコルを報告している。この方法は胚¹³の開発を監視することができますし、注入物および/ ​​または標識された細胞の長期的なフォローアップが可能になります。

我々は、これらのアプローチは、臓器の機能を保存し、幹細胞の潜在的なin vitro試験よりも代表的な環境を提供することを見出した。また、移動を追跡する機会を提供標識および/またはそれらの運命をモニターするための細胞の注射。最終的に、これは、地域、組織パターニングおよびキー生物学的プロセスのより良い理解を得るべきである。

プロトコル

1。準備

動物の手続き

動物の倫理委員会の承認を得て、ウイルスに仕事のための施設のガイドラインに従って、HuESCおよび/またはIPSC（該当する場合）だけでなく、マウス操作、マウス胚を取得し、マウスの手術を行う。時限交配のために、プラグの日は胎生（E）0.5 / 0.5日後に交尾と考えられている。

1. マイクロインジェクション針：
   子宮外マイクロインジェクションのために、1または10μMの内部先端径はそれぞれ、DNAまたは細胞を注入するシャープで円錐先端形状を取得するために、ピペットプラー/ bevellerを用いてガラスピペット（1.2ミリメートル外径ホウケイ酸キャピラリーチューブ）を引き出します。超音波媒介注射のために、35分の50ミクロンの外径/内径の先端で、1.14 mm/0.53 mmで、内/外径（OD / ID）を持つカスタマイズされた無菌の注射針を使用しています。
2. シリコンで満たされたペトリ皿：
   マニュアルに記載されているようにシリコンを準備します。埋める〜1cmのエラストマー層との清浄なガラス直径60mmのペトリ皿。空気の泡を避けてください。
3. 楽器：
   手術中前および無菌すべて手術器具を保管してください。
4. DNAの調製：
   1チューブ内で3μgのDNAと12μLのOpti-MEMを追加します。 3μLリポフェクタミン2000および12μLのOpti-MEMを別のチューブに追加します。室温で5分間インキュベートし、両方の溶液を混合。すぐに使用してください。
5. 細胞調製：
   10 ⁶個/ mLのDMEM（ダルベッコのイーグル培地、高グルコース、50％ラット血清）の懸濁液を準備します。最終的な細胞懸濁液50μlを8月10日の胚のために十分である。
6. 染料の準備：
   緑色蛍光CDCFDA-SEは、25 mg / mlのDMSOで使用してください。 -20℃で20μlを、ストアを準備します使用前に滅菌生理食塩水またはPBSで1:100 / 1:200に希釈する。
7. ウイルス調製：
   約10 ^{9〜10 10}のtraの力価を有する市販の第3 ^世代 PGK-GFPを発現するレンチウイルスを使用単位/ mlのDMEMをnsducing。レンチウイルスの調製のために、Tiscornia らを参照してください^。14個人用保護具を着用し、安全に使用し、ウイルスを処分。

生体外注射用E9.5とE10.5胚の2。コレクション

1. 胎生9.5または10.5で、妊娠中のマウスを安楽死させる。
2. 70％エタノールでマウスの胸部と腹部を消毒。
3. 腹部を開き、PBS中に室温で子宮角を取得し、M16培地を有するシリコーンで満たされたペトリ皿に2回のPBS洗浄後にそれを転送するために腹側正中切開を行います。
4. 子宮の血管化側が下になるようにシリコーン層に虫ピンで子宮角をピン。
5. 細かい鉗子で子宮の表面をカットし、表面下1ミリメートルの脱落膜のキャップ。
6. 優しく脱落膜の壁を広げることにより、卵黄嚢に胚を取得します。
7. 37℃で胚を保存する;細胞注入の前にM16培地中のC。注射のために、各胚をM16培地で37℃で予備加温しが充填されたシリコーン皿に転送される

実体顕微鏡下で3。、DNAや細胞注入

1. ハミルトンシリンジを背面からガラスピペットを記入し、先端に気泡を除去するために、ピペットを振る。
2. マイクロインジェクションホルダーにピペットを設定します。 50保持圧力（DNA）または30（セル）ヘクトパスカル、および300（セル）に150の噴射圧（DNA）ヘクトパスカルに設定してください。 0.2秒（DNA）または0.5秒（セル）に噴射時間を設定します。これらの設定は、わずかにマイクロインジェクターやピペットの種類に応じて異なる場合があります。
3. 適切な胚を触れることなく、卵黄嚢を通してシリコン底に胚をピン。心の領域を見て、ちょうどこの領域の上方に嚢を開きます。
4. 細胞注入の際に任意の運動を防止するために、胚の周囲に4つのピンを追加します。
5. （manualに設定）マイクロマニピュレーターを用いて、slowlただ（図1）を注入することで、心臓の領域の上方心膜上45°の角度で、y位置ピペットチップ、。
6. 関心領域にピペットを移動して、注入を誘発する。可能な限り迅速にピペットを取り出します。心臓が正常にDNA /細胞注入後に暴行されていることを確認してください。

4。胚、単離心臓、外植文化

1. 培養25％M2培地およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充した75％ラット血清、37℃で予備加温し、40％O ₂で酸素化におけるE9.5胚。
2. チューブにキャップをねじ込む前に、25 mlのガラスチューブ中の2mlの培養培地を穏やかに入れる胚を追加し、40％のO ₂を有する含酸素化合物。回転又は（30回転/分）で振盪しながら37℃で36時間までインキュベートする。
3. 所望の時点（ 例えば、24時間）で、第1の逆によって、心臓に触れることなく、微細なピンセットで慎重に心臓を解剖胚をcapitating;心臓は、遠位流出路を使用してそれを引き出して切除することは容易である。
4. 文化12ウェルプレートにセットマトリゲル被覆されたインサートを50％FCSを含むDMEM中で、別の36〜48時間の心臓を単離した。心臓の文化¹⁵の改良プロトコルに対してダイアー·パターソン（2013）を参照してください。
5. 関心領域のいずれかの外植片を作る。例として、1型コラーゲンゲル¹⁶上で48時間、房室運河（AVC）や文化を解剖。

ハートI N子宮内 5。超音波ガイド下注入

1. 超音波装置やマイクロインジェクターのセットアップ：
   1. レール上の40 MHzのトランスデューサおよびマイクロインジェクションのセットアップを高解像度の超音波システムを使用してください。
   2. 注射あたり69 NLでマイクロインジェクターで注入量を設定します。マイクロインジェクターをプログラミングするためのメーカーのマイクロインジェクションのマニュアルを参照してください。
2. microiの調製njectionセットアップと注入：
   1. マイクロインジェクターガラスマイクロピペットを置きます。最大音量まで吸引することにより、効率的な注入、第一コートのミネラルオイルをピペットの内側を確保する。その後、針内のオイルに1-2mmを残して、再び油を取り出します。
   2. 最大音量に達するまで注入液を吸引する。これは、先端を鈍らし、注入がより困難になりますので、針の先端を任意の表面に触れないように注意してください。
   3. 注入中に胚を含む子宮角を安定させるために、中央にカットし、小さなスリットを備えた薄いシリコーン膜で覆われて中央に穴を有する変性ペトリ皿（直径2.5cm）を使用し、切開部位の上にそれを置く。お皿の縁の下に粘土の3-4塊を配置することによって、マウス操作テーブル上のペトリ皿を安定させる。
3. 注入手順：
   1. 麻酔し前に（必要な胚段階で）妊娠したマウスの腹部を剃るSIAは、髪を削除します。残留毛髪を除去し、70％エタノールで滅菌する化学的除毛剤で腹部を治療する。
   2. フェイスマスクを介して酸素/イソフルランを妊娠マウスを麻酔。残りの手順の間に1から1.5パーセントに続いて、最初の麻酔のための100％酸素、3〜5％イソフルランを使用してください。マウスが十分に静かに足および/または尾をつまんで麻酔していることを確認します。
   3. （37℃に加熱するように設定された）マウス操作テーブルの上にマウス仰臥位を置き、角膜の脱水を防ぐために、潤滑剤の目をカバーしています。
   4. 電極上に電極ゲルを適用し、心拍数、呼吸数、およびECGを監視するために、電極に足をテープ。体温を監視するために、直腸温度計を置きます。
   5. 最初のマウスを可視化し、超音波によって胚をカウントすることで妊娠していることを確認してください。腹部に超音波ゲルを適用し、膀胱の上にスキャンヘッドを配置します。一貫性を保つため、第1の袋を視覚化、膀胱の位置から開始して、左右の子宮角に胚を数える。胚の心は正常に鼓動していることを確認します。
   6. マウスが妊娠している場合には、粘土との将来の切開部位上のペトリ皿を置きます。料理が直接接触するように、少し腹の上の皿を押してください。
   7. お皿を取り外し、再び腹部を消毒。腹部と腹膜を開くには、約0.75〜1センチメートル膣の上に、1.5〜2センチメートル腹側正中切開を行います。内臓への損傷を避ける。
   8. ピンセットで左または右の子宮角を体外に、静かに皿のシリコン膜を介して、それを引っ張って、もう一度粘土上のお皿を安定させる。これは子宮血管の出血や、女性および/または胚の早すぎる死を引き起こす可能性があるので、引っ張って広範または操作を防ぐ。
   9. 胚を注入したの十分な記録管理を確実にするために、再び胚を数える。
   10. Uに超音波ゲルを適用画像terineホーン心と脱水を防ぐために。
   11. 画像を注射された最初の胚。胚心臓の正常な鼓動を確認し、胚の尾側頭蓋左右方向の記録を保持。必要に応じて、適切な配向を確実にするためにわずかに子宮角の位置を変更する。これは困難なことが判明した場合、次の胚に移動します。
   12. わずかに心膜（ 図3）の外側に、胚上記45°の角度で針を位置決めするマイクロインジェクション針を慎重に子宮を穿刺する。それは房室溝（ 図3）に向かって指すように心外膜細胞の標識のために、画像4腔像における心と針を配置。角度を調整する必要がある場合には、針を引き出し、および再配置します。これは、針を破る可能性があるため、子宮の内側の針と角度を調整しないでください。このような手足や胎盤などの他の組織を穿刺することは避けてください。
   13. 針を動かす心膜の壁の上に、穏やかな、しかし迅速な動きでそれを穿刺。一般的には、そこにいくつかの抵抗になりますが、速すぎて針を移動すると、針の先端が心臓自体を穿刺する可能性があります。先端は房室溝の心膜腔に終わる必要があります。心膜出血例では、血液細胞は、白い雪のようなパターンとして表示されます。このような場合は、胚を注入停止し、別の胚に移る。
   14. 注入液を注入する。心の発達への悪影響を防ぐために、心膜腔に最大限700 NLを注入する。心膜嚢のわずかな時間的膨潤させることで、適切な注入を監視します。
   15. 注射後、外針を引き出し、その注入液を確認し、まだ針が組織断片により目詰まりしなかったことを確実にするために吐出することができる。
   16. 画像に処理テーブルの位置を変更し、次の胚を注入する。防止するために、（1子宮角で）3-4訳注注入した胚の数を維持する反対子宮角の制御の胚を可能にするために、プロシージャは、胚発生を妨げないことを確実にするために、麻酔を延長した。
   17. 胚の希望数を注入した後、余分な超音波ゲルを取り外し、ゆっくりとその適切な位置に戻って腹部に子宮角に配置します。
   18. 腹膜や腹筋、および皮膚の縫合糸の第二層のための縫合糸の1層を用いて母体の腹部を閉じます。
   19. 鎮痛薬の初回投与でマウスを注入する。前12時間の間隔で麻酔し、3つの追加の注入を終了する0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィン15分の1の注入を使用してください。
   20. 麻酔を中止し、プロシージャから十分な回復のためのマウスを監視します。家のフォローアップの所望の期間のための個々のケージに妊娠したマウス。

結果

上述した注入プロトコルを用いて、細胞を標識および/または、胚性マウスの心臓に注入することができる。概念の証明として、いくつかの例は、注入プロトコルおよび ex vivo AVC外植片、単離された心臓、又は全胚培養物（ 図1）を組み合わせたものに示されている。

図1は、細胞の注入前の胚の調製を示す。卵黄嚢（ 図1A）

ディスカッション

上述の心臓内エクスビボ注入プロトコルは、中間段（E9.5〜E11.5）のマウス胚において少なくとも48時間心筋機能を維持するように設計されている。これらの注入のアプローチは、DNAや細胞の空間的に目標と注入を可能にします。 図1〜図3に示すいくつかの例は、ex vivoで 、そのような心内膜または心外膜細胞のEMTとして制限された心臓の地域で行われる発生過程の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019