からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

要約

ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。

要約

キイロショウジョウバエ胚および幼虫の組織はしばしば、これらの組織における遺伝子発現の分析を複雑にすることができる細胞型の高度に不均一な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、高純度のような転写プロファイリングおよびクロマチン免疫沈降などの下流のアプリケーションに十分な収率で特定の細胞型を単離することが必要であり得る。しかしながら、これらの組織における特定の細胞型の稀な集団と結合し、中枢神経系のような組織内の不規則な細胞形態は、例えば、レーザーマイクロダイセクションおよび蛍光活性化細胞選別（FACS）などの細胞単離の伝統的な方法のための課題を提起することができ。ここで、タグ付けされた核の親和性に基づく分離ではなく、全細胞を用いた細胞特異的遺伝子発現プロファイルを特徴付けるための別のアプローチは、記載されている。特定のC言語での核興味のあるエル·タイプは、遺伝的にGal4/UASバイナリー発現系を用いて核膜に局在するEGFPタグで標識する。これらのEGFPタグ付き核磁気ビーズに結合されるGFPに対する抗体を用いて単離することができる。このプロトコルで説明されたアプローチは、これらの細胞型には、全細胞集団の2％未満を含む場合であっても、高純度でかつ発現分析のために十分なレベルで、ショウジョウバエの幼虫中枢神経系の特定の細胞型からの核の一貫した分離を可能にする組織。このアプローチは、 ショウジョウバエ胚および特定のGal4のドライバを使用して、幼虫の多種多様な細胞型から核を単離するために使用することができ、FACSまたはレーザーマイクロダイセクションには適していない細胞型から核を単離するために有用であり得る。

概要

中枢神経系のようなショウジョウバエ組織は細胞型の複雑な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、それは下流の適用を可能にするのに十分な量の特異的細胞の均質な集団を単離することがまず必要である。無傷の組織から細胞を単離するための方法は、全細胞のレーザーマイクロダイセクション、および蛍光活性化細胞選別（FACS）が挙げられる。 FACS ^1-3遺伝子発現^{プロファイリング}およびクロマチンのためのショウジョウバエ胚から線虫（Caenorhabditis elegans）由来の細胞および核を単離するために使用されてきたが、FACS、レーザーマイクロダイセクションは、高度に相互に混合細胞型を含むかを有する細胞を含有する組織において正常に行うことが困難であることができるニューロンなどの不規則な形態、。この困難を克服するために、核ではなく、細胞が特定の細胞型から単離し、その後の世代のために使用することができる電子発現プロファイリング。重要なことに、核RNA試料を用いたマイクロアレイベースmRNA発現分析は、総RNA ^4,5を用いて行わとほぼ同等の結果を示している。また、核のRNAを用いた遺伝子発現解析は、正常C.含む複数の生物における遺伝子発現を研究するために使用されている線虫 、 シロイヌナズナ 、 ショウジョウバエ、およびヒト^{4、5 2、3。}

いくつかのアプローチが最近、遺伝子発現解析及び/又はクロマチン免疫沈降するのに適しているショウジョウバエの組織からの標識された核の特定の集団を単離するために記載されている。免疫沈降（BITS-チップ）方式のための組織特異的なクロマチンのバッチ分離が核に局在するGFP ²の細胞型特異的発現に基づいて固定された核を分離するために、FACSを利用しています。このアプローチは、SUでしたccessfully ショウジョウバエの胚の中胚葉²から単離された核のクロマチン免疫沈降を用いて、ヒストン修飾と転写因子の分布を解析するために使用される。しかし、FACSベースのアプローチは、ダウンストリームアプリケーションのための適切な数値を得るために必要な増加したソート時間に混合された集団のわずかな割合を構成標識核を単離するにはあまり適切であり得る。これらの制限を克服するために、いくつかのグループが、特定の細胞型に特異的なエピトープで標識された核を精製するために親和性に基づく分離技術を利用している。 シロイヌナズナ^6,7における使用のために開発された特定の細胞型（INTACT）メソッドのタグ付け核の単離は、最近、 ショウジョウバエ ⁸での使用に適合されている。この方法では、in vivoでのビオチン化のための基質である核エンベロープ融合タンパク質であるcoexpres特定の細胞型において大腸菌ビオチンリガーゼBirAを用いてセッド。ビオチン標識された核は、続いてストレプトアビジン - ベースの親和性単離を用いて混合集団から精製することができる。このアプローチを用いて、核は正常核エンベロープ融合タンパク質は中胚葉特異的エンハンサー⁸の制御下で発現させたショウジョウバエ胚の中胚葉に標識し、単離した。著者らはまた、Gal4の調節配列、UAS ⁹の制御下で任意の細胞型で発現させることができる核エンベロープ融合タンパク質を生成した。このアプローチは、急速に混合集団から標識核のサブセットを単離することができるが、3つの別々のトランスジェニック構築物を必要とし、したがって特定の遺伝子の用途には不向きであってもよい。最近、このアプローチは、核膜の内膜に局在SUN（S AD1及びUN-C 84）ドメイン含有タンパク質を用いてタグ付けされた記載されている蛍光タンパク質とGal4/UASシステム¹⁰の制御下で発現。核は、核膜の外膜を除去するために非イオン性界面活性剤の存在下で単離され、抗GFP抗体に結合した磁気ビーズを用いてアフィニティー精製した。このアプローチは、正常ショウジョウバエ ¹⁰の成体脳内の特定のニューロンのサブタイプからの標識された核の小集団を単離するために使用した。

ここで、 ショウジョウバエ幼虫の組織からの細胞の混合集団から標識核を単離するためのプロトコルが記載されている。この方法は、独立して開発されたが、ヘンリーらによって記載されたアプローチに似ていた^。10まず、核が混合集団からのタグ付けされた核のその後の単離を容易にするためにのみキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）における特定の細胞型で発現される蛍光タグで標識した親和性ベースのアプローチを使用して。核を標識するために、KASH（Kの larsicht / NC-1 / Sの -インの時間 omology）ドメインを利用した。 KASHドメインは、核周囲の空間¹¹内に日ドメイン含有タンパク質との相互作用を介して部分的には、核膜の外膜に局在する膜貫通ドメインである。そのN末端 ​​ドメインは、細胞質^12-14におけるアクチンまたは微小管などの細胞骨格タンパク質と相互作用しながら、ショウジョウバエ MSP-300およびKlarsichtなどのタンパク質のC-末端KASHドメインは、外核膜にこれらのタンパク質を固定する。構築物は、ここで、ショウジョウバエ MSP-300のKASHドメインはのpUASTベクターの^attB-15、16でGal4の調節配列、UASの制御下で、EGFPのC末端に融合された生成された。ラーゼPhiC31の部位特異的組込みを使用して、トランスジェニックハエをUAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH導入^遺伝子が染色体上attP2遺伝子座に挿入された生成された3L ^17。 UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASHハエは、目的の細胞型における外顆粒膜上の標的EGFP発現をもたらす、特定の細胞型においてGal4ドライバーを発現するハエと交配させることができる。標識された核は、磁気ビーズに結合されたGFPに対する抗体を用いて、混合細胞集団から精製することができる。 EGFPタグは、外核膜の細胞質側に局在し、したがって、抗体にアクセス可能であるため、このアプローチでは、非イオン性界面活性剤の使用が必要とされない。

プロトコルは、以下に説明/単離するショウジョウバエ幼虫の組織における特定の細胞型からのEGFP-標識核を富化、単離された核の純度および収率を定量化するため、および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRTに適した核内RNAを抽出するために使用することができる-PCR）遺伝子発現解析。 TISSU除く分離と核のアフィニティー精製（電子郭清）1時間未満で行うことができる。結果は、グリア細胞核は正常幼虫の光学ローブと眼成虫盤から単離し、その後の遺伝子発現分析のために使用することができることを示して提示される。なお、この方法は、標的細胞は、総人口の5％未満を構成する胚および幼虫の組織からの標識された核の分離/富化のために有用であろうことが予想される。この研究で生成されたすべてのショウジョウバエの株式やプラスミドは要望に応じて作成者から入手できます。

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プロトコル

1。 EGFP :: KASH ショウジョウバエの発生と特性評価

1. クロスGal4ドライバーは、MSP-300 ^KASHが飛ぶ:: UAS-EGFPを運行する。代わりに、Gal4ドライバーとUAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH導入^遺伝子の両方を運ぶ組換えハエは、標準的な遺伝子技術を用いて作製することができる。多数の子孫が必要な場合には、この第二のアプローチは、有利である。
2. 標準顕微鏡技術を用いて、EGFP :: KASHマーカーの発現を特徴づける。注：EGFP発現は、全体又は幼虫において、解剖固定ショウジョウバエ組織において標準的な顕微鏡技術によって観察することができ、抗体の使用を必要としない。
   1. EGFPの発現パターンを決定::蛍光解剖顕微鏡下で、生物全体におけるKASHマーカーは（材料のPDFを参照してください）​​。注： 図1に示すレポGAL4ドライバー 、展示Nを含む多くのGal4ドライバーを、このような唾液腺などの他の幼虫組織における発現のonspecificパターン（結果を参照）。
   2. 共焦点顕微鏡を用いて関心を解剖組織におけるEGFP :: KASH発現パターンを分析します。
      1. EGFPの局在:: DNAにKASHタグに関連を可視化するために0.1μg/ mlの最終濃度DAPIを使用して、最終的な4パーセントの濃度、および耐汚染DNAでホルムアルデヒドを使用して目的の組織を固定します。
      2. 40倍/ 1.30油浸対物レンズまたは目的の組織の大きさに応じて20倍/ 0.75油浸対物レンズ、のいずれかを使用して画像を取得する。次の励起/発光条件は、画像取得のために使用することができます：408 nm/425-475ナノメートル（DAPI）; 488ナノメートル/ 525から550ナノメートル（GFP）。

2。 ショウジョウバエ幼虫の組織から核を分離する

1. 幼虫組織切開とその後の核の分離のための機器を準備します。あることに注意してください全体絨毛膜を除去した胚はまた、所望であれば、出発材料として使用することができる。それは、目的の細胞型は、成虫盤のような特定の組織中に存在している場合ではなく、全体の幼虫よりも部分的に切開し、幼虫の組織を使用することをお勧めします。これは非特異的結合が減少し、また、非標的細胞におけるいくつかのGal4ドライバーの発現によって引き起こされる可能性の問題を排除します。
   1. 鋭い鉗子二対（材料PDFを参照）、1つシリコーン処理9ウェルガラス板を作製し（材料PDF参照）、PBT（1×PBS、pH7.4中、0.1％のTween-20）。
   2. 磁気ビーズにGFP抗体を丈夫に製本する。このステップは、解剖を開始する前に起動する必要があります。 1.5ミリリットルチューブ内で、（2.5のMgCl ₂ 1X PBS、pH7.4）で洗浄緩衝液400μlに（ロシュは、資料のPDFを参照してください）（材料PDFファイルを参照して、Invitrogen）を磁気ビーズを10μlを加え、GFP抗体2μgの。必要に応じて使用したビーズと抗体の量は、サンプリング中の標的の量に基づいて最適化することができるPLEおよびビーズへの抗体の結合親和性。
   3. 室温で少なくとも30分間、回転させながら、ビーズおよび抗体をインキュベートする。
   4. 磁気ラック内のビーズと抗体を含む1.5 mlチューブを配置（材料のPDFを参照）、ビーズは約1〜2分間磁気的に結合することができます。非結合抗体を含む上清を除去し、1ミリリットルピペットを使用してバッファを洗う。ビーズは、磁石に隣接する側の1.5ミリリットルチューブの壁に結合されたままになります。
   5. セクション2.1.4で説明したように毎回洗浄緩衝液の1ミリリットルで二回ビーズを洗浄します。磁気ラックから1.5ミリリットルチューブを外し、ビーズをミックスし、各洗浄工程の間にバッファーを洗浄するために簡単に反転させる。
   6. ステップ2.7に進んで準備ができるまで、洗浄緩衝液中の抗体結合ビーズを格納します。ビーズは、プロトコルのどの段階で完全に乾燥させてはならない。
2. PBTおよび転送中の幼虫組織を分析する組織を切開し9ウェルディッシュの1ウェル。一般的に、100 3齢幼虫からオプテ​​ィックローブと目成虫原基の解剖は、核単離後、下流の遺伝子発現解析のために十分な材料を提供しています。
3. 1.5mlチューブに核抽出緩衝液中で単離された組織を洗い流す（10mMのKClを10mMのHEPES-KOH、pH7.5の;、2.5のMgCl _2）。新鮮な核抽出緩衝液1ミリリットルが含まれている1ミリリットルダウンスホモジナイザー（資料PDFを参照）、氷上に孤立幼虫組織を転送します。氷上で5分間インキュベートする。これは、RNAが核単離後、抽出される場合、プロテアーゼ阻害剤を添加する必要はない。
4. 緩い乳棒で20ストロークで組織を破壊し、その後、細胞が膨潤することを可能にするために10分間氷上でサンプルをインキュベートする。タイト乳棒で15ストロークを用いて細胞から核を抽出します。ルーズとタイト杵とストロークの数は、異なる組織および細胞型のために最適化される必要がある;過剰均質化をもたらすことができる不十分な均質化が組織から全ての核を抽出しませんが、核をせん断し。
5. 核の均質化緩衝液であらかじめ浸漬されている40ミクロ​​ンの細孔サイズのストレーナー（材料のPDFを参照）を介して、核および細胞破片が含まれているホモジネートをフィルタリング。新しいチューブでフィルタリングホモジネートを収集します。
6. 核収率、核の完全性を決定するために、その後の分析のための事前の分離サンプルを採取し、単離を核に先立って標的遺伝子の転写レベルを決定する。
   1. ピペットを使用して新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート50μlの。これは、 予備分離試料である。 Trizol試薬を500μlを追加し、その後のRNA分離（ステップ3.1）、-20℃で、混合する反転、店舗（材料をPDF、注意を参照のこと）。
   2. 新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート20μlの。
      1. 0.1μg/ mlのの最終濃度にDAPIを追加し、株式会社10分間氷上でubateサンプル。
      2. ポリリジンコートされたカバーガラスに、DAPI染色された核を転送し、顕微鏡スライド上に配置します。明確なマニキュアを使用してカバースリップをシール。
      3. 核の完全性を確認し、蛍光顕微鏡を用いて目的のGFPタグ核の存在。注：核を修正するために、またはこれらのスライドは、（24時間以内）に調製後、合理的に迅速に分析している場合は、GFPを染色する必要はありません。
   3. 新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート10μlの洗浄緩衝液90μlの（1×PBS、pH7.4の、2.5のMgCl _2）を追加します。 0.1μgの/ mlの最終濃度にDAPIを追加し、氷上で10分間インキュベートする。 10倍の空気目標の下で落射蛍光を使用して、DAPI陽性核をカウントする血球計数器を用いて事前に分離サンプル中の核収量を決定します。
7. 磁気ラックに（セクション2.1.6で調製した）抗体結合ビーズを含む1.5ミリリットルチューブを配置し、およびセクション2.1.4に記載したように磁気ビーズは、少なくとも2分間磁石に結合させる。 1ミリリットルピペットを用いて抗体結合ビーズから洗浄バッファーを削除し、1ミリリットルピペットを用いて、1.5mlのチューブにステップ2.5から濾過ホモジネートを追加します。
8. 穏やかに混合するためにチューブを数回転倒し、転倒攪拌しながら30分間、4℃でインキュベートする。可能な場合、これらは核の凝集を引き起こすことができるため、チューブ内の気泡を避けてください。
9. 磁気ラックに抗体結合ビーズとホモジネートを含む1.5 mlチューブを配置し、セクション2.1.4で説明したように磁気ビーズは、少なくとも2分間磁石に結合することを可能にする。 1ミリリットルピペットを用いて、結合していない核画分を含むホモジネートを削除します。
10. 毎回洗浄緩衝液1mlでサンプル3回洗浄します。説明したようにビーズ、結合された核を含む1.5 mlチューブを外し、ラックからバッファを洗って、数回転倒混和し、その後、磁気ラックにチューブを配置ステップ2.9で、1mlのピペットを用いて上清を除去します。
11. ターゲット核にバインドする際、ビーズに洗浄緩衝液150μLを加える。これが後のアイソレーションサンプルです。顕微鏡分析とその後のRNA抽出のためのサンプルを準備します。
    1. 新しい1.5 mlチューブおよびDAPIで染色への転送後、分離サンプルを20μlとセクション2.6.2で説明したように分析する。 GFP + / DAPI +及び単離後試料中の濃縮されたGFP +核の純度を決定するために、磁性ビーズにより捕捉GFP-/DAPI +核を数える。
    2. その後のRNA単離（ステップ3.1）のために、 後の分離サンプルの残りにTrizol試薬の1ミリリットルを加える混合する反転し、-20℃で保存。注：必要に応じて、トリゾールのサンプルは-20℃で数週間保存することができますなお、Trizol試薬を用いてRNA抽出前に磁気ビーズから核を溶出するために必要ではないのbecausEビーズは、その後のRNA分離に干渉しない。

3。幼虫の組織から単離された核における転写レベルを決定する

1. 以下のように変更して（材料のPDFを参照）トリゾールベースのRNA抽出に記載されている標準的なプロトコルを使用してのセクション2.6.1および2.11.2で作成前の分離および単離後のサンプルからRNAを単離する。
   1. RNAペレットの沈殿後、ペレットにRNaseフリー水19.2μLとRNASecure試薬0.8μL（材料のPDFを参照）を追加し、RNA分解酵素を不活性化する20分間60℃でインキュベートする。
2. 製造業者のプロトコルに従ってQubitR 2.0蛍光光度計を使用して、このような量子ビットのRNAアッセイキットなどの蛍光-RNA結合色素（原材料のPDFを参照）RNA濃度を決定します。
3. 例えばEpiScrとして増幅し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成IPT製造者の指示に従って転写酵素キットとオリゴdTプライマーを逆にします。注意：一般的に、RNAの50から100 ngのは、複数の遺伝子発現解析を実行するのに十分なのcDNAを生成します。 予め単離およびRNA 単離後の当量は、cDNAを作製するために使用されるべきである。
4. 前のリアルタイム定量PCR（定量PCR）分析は、この10倍に希釈するために20μlのcDNAサンプルにヌクレアーゼフリー水180μlのを追加します。未希釈のcDNAサンプルが定量PCRを阻害することができるので、この希釈は、重要なステップである。
5. ポリメラーゼおよびdNTP、4ピコモル前進のそれぞれと定量PCRマスターミックスを調製し、リバースプライマー、20μlの最終反応容量を滅菌水で作りました。
   1. 目的の細胞型で発現されると予想される遺伝子を標的とし、組織が収集された発達段階にするために定量PCRプライマーを設計する。イントロンにまたがるための設計プライマー可能ならば、その結果、ゲノムおよびcDNAのPCR産物を区別することができる。注：標的細胞型の遺伝子発現プロファイルは知られていない場合、タグ付き核集団において特異的に発現されるべきでのeGFPに対するプライマーは、特定の細胞型および組織（ 表1）のためのプロトコルを最適化するために使用することができる。
6. 全組織から調製したcDNAの希釈系列と比較することによって、事前分離と単離後の試料中の目的の各遺伝子の相対的な転写レベルを決定します。標的遺伝子の転写物レベルは、例えば、RPL32（または好ましくはいくつかの参照遺伝子）等の参照遺伝子に対して正規化されるべきである。

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結果

レポGAL4ドライバー （ブルーミントンストック番号7415）は、具体的な開発¹⁸の複数の段階でショウジョウバエ神経系のグリア細胞で発現されている。ハエを安定的に標準的な遺伝子技術を使用してレポGAL4ドライバの制御下に、UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASHを発現すること^を生成した。これらのハエにおけるEGFP :: KASH導入遺伝子の発現パターンを...

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ディスカッション

このプロトコルは、 ショウジョウバエの胚または幼虫組織における混合細胞集団から、特にタグ付けされた核を隔離するか、非常に豊かにするために使用できます。このプロトコルを使用して、核は約1時間で解剖した組織から単離することができる。単離された核の純度および収率は、実験的に各細胞型について決定されなければならない。それがために、試料中に存在するビーズ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L