患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

要約

我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。

要約

転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。

概要

転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の^1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞³で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） ^{は1〜E-selectin/selectin}リガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。

しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 ⁹血液細胞あたり1 ^CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で^、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。

私たちの方法論は、生体内血管系^7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライド^{III（0.1）は} 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態¹⁰で観察することができる。

プロトコル

観測CTC - 内皮相互作用のためのマイクロスライド上の1。培養のHUVEC

1. 組織培養フードの下では、まず、PBSで1mmのチャネル幅をマイクロスライドをすすぐ。優しくコート1ミリリットルルアーロック注射器を用いて50μg/ mlのフィブロネクチン（PBSに溶解）200μlのマイクロスライド。
2. 蓋付きのマイクロスライドをカバーし、30分間組織培養フードの中に保管してください。マイクロスライド内の液体の遅い分注は、チャネル内の気泡の形成を防ぐことができます。
3. マイクロスライド上に温かい（37°C）HUVEC増殖培地200μl（M199培地、1M HEPES、20％FBS、5 mg / mlのヘパリン、100μg/ mlの内皮細胞成長因子、及びL-グルタミン）を灌流し、インキュベートRTで20分。灌流中、HUVEC細胞懸濁液を調製。
4. PBSでのHUVECをすすぎ、室温で1〜2分間、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5分間180×gでの2mlの増殖培地中でHUVECを遠心分離機。
5. neubaを用いて細胞濃度を測定UERの血球計数器および増殖培地μL10 ⁷のHUVEC cells/100を準備します。その後、慎重に200μlのピペットチップを用いてマイクロスライドの入口からメディアを取り出します。
6. 目の高さにマイクロスライドを持参し、1 mlのルアーロック注射器を用いて、そっとチャンネルにHUVECの準備濃度の200μLを灌流。注意気泡形成を防ぐために、この段階で必要とされる。気泡が表示された場合、気泡が出口チャネルを入力するまで、わずかにより長い時間灌流キープ。
7. マイクロスライドの入口と出口の両方でのHUVECメディア、等量の（〜80μl）を置く。これは、いずれかの方向における細胞の流れを防止する。
8. スライドをカバーし、1.5時間、インキュベーター（37℃）に保管してください。

ミクロスライド上で一晩HUVEC文化のためのフロー商工総会の2。準備

1. 15マイルのためのインキュベーター内の滅菌20 mlの注射器、メスとオスルアーコネクタ、チューブ、シリンジポンプを配置N。
2. 最小限のデッドボリュームの場合は、0.04インチの内径のチューブを使用しています。より小さなチューブ径が気泡形成を防止する。
3. 温かい（37℃）、HUVEC培地（12ml）で20 mlの注射器を埋める。注射器の上にコネクタを備えたチューブを取り付けます。気泡を除去する。マイクロスライドにこのアセンブリを接続します。
4. 完全HUVEC培地でマイクロスライドの入口を埋める。マイクロスライドの横のコネクタに接続され満たされた20 mlの注射器を持参してください。静かにマイクロスライドにコネクタを取り付けます。
5. インキュベーターにセットアップを持参し、10μL/分のせん断速度に設定したシリンジポンプに接続します。 37℃のインキュベーター内で細胞のO / Nを残す
6. 次の日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタを削除することで、セットアップを分解します。
7. ECの上、E-セレクチンの発現を上方制御するために、4ミリリットルのメディアが10 ng / mlの時に、IL-1βを含む新鮮な増殖培地を準備します。 10 mlの注射器でメディアを吸引除去する。 Tを削除彼マイクロスライドの入口からメディアやスライドにシリンジを接続します。
8. インキュベーター内で4時間10μL/分の剪断速度でシリンジポンプを設定します。

3。抗PSMAの調製（J591-488）ラベル前立腺癌細胞

1. HUVECのIL-1βのインキュベーションの間、抗PSMA J591-をAlexa488ラベルのPCa細胞を調製。 1分間MDA細胞を0.05％トリプシン-EDTAを追加します。それが細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与えることができるように長い時間のために、トリプシンに細胞を放置しないでください。酵素を含まない細胞解離試薬はまた、代わりに、トリプシンを使用することができる。 5分間200×gで遠心分離する。
2. 1ミリリットルのH / Hバッファー（ハンクスsolution/0.1％HSA/10のHEPES / 1のCaCl _2）でのMDA細胞ペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-のAlexa488抗体を追加します。インキュベーション中に細胞を再懸濁。
3. 30分後、5分間800×gで細胞溶液を遠心する。 ASPIレートと1ミリリットルのH / Hバッファにペレットを再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、1×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度をもたらす。 J591-488ラベルされたMDA細胞を5 mLの注射器を記入し、気泡を除去。

PCaの患者から4。抗PSMAの調製（J591-488）ラベルのCTCエンリッチ

1. （クエン酸ナトリウムを含有する）は青キャップチューブに前立腺癌患者から7.5ミリリットルの血液を収集する。穏やかに0.1％BSA / 1 mMのEDTA / PBS中の血液1:1に希釈する。
2. 5.3ミリリットルフィコール·パックプラス50mlのコニカルチューブに追加します。層は、フィコール·パックの上に血を希釈した。 30分間400×gで遠心分離する。
3. プレコート全てのチューブまたは先端が2％FBS/RPMI-1640 / 1mMのCaCl _2/4のMgCl ₂表面へのCTCの非特異的結合を防ぐために、（R / S緩衝液）を用いたCTCと接触する。 CTCのと接触メディアとバッファの4℃の温度を維持する。
4. 末梢血単核細胞（PBMC）を画分を集め30ミリリットルのR / Sバッファを含む別の50 mlのコニカルチューブ内のインタフェースからのCTCを含む。 8分間400×gで遠心分離する。
5. ペレットを再懸濁し、8分間、400×gでR / S緩衝液中で再度洗浄する。遠心分離した後、H / Hバッファーでペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-488抗体を追加します。
6. 30分後、J591-488を含む遠心PBMCを、5分間、800×gでのCTCを標識した。 H / Hのバッファに再懸濁。試料と（R / S緩衝液で予めコーティング）1mlシリンジを充填する。

5。顕微鏡の準備、シリンジポンプおよびフロー商工総会

1. 倒立顕微鏡の電源をオンにして、10倍の対物レンズでケーラー照明を設定します。顕微鏡の試料ステージと同じレベルで、シリンジポンプを持参し、1ダイン/ cm ^2のせん断応力（〜10μL/分）で設定してください。
2. ツァイスAxioVisionのソフトウェアを起動します。コンピュータ画面上の目的を選択します。新規作成ソフトウェアの[ツール]オプションの下にあるフォルダ。
3. AxioVisionのスマート実験オプションを開いて、30分間の短い30秒のビデオを記録するために設定を調整します。
4. ライブの蛍光ビデオ、画像オプション-12秒露出、2×2ビン、5ゲインを設定します。これらのパラメータは、ツァイスMRMカメラでビデオのフレームレート（毎秒約23フレーム）に近いビデオを達成するの​​に役立ちます。
5. コンピュータの画面に10のX目的で流路の幅全体を可視化するために、Cマウントアダプター（0.63 xf/60 mmインタフェース）を使用します。
6. 水銀ランプのスイッチをオンにします。
7. シリンジとシリンジポンプ上に細胞を含むコネクタを配置します。
8. IL-1βは、インキュベーターからのHUVECを刺激させる。 HUVECをを含むマイクロスライドの塗りつぶされた入口チャネルへのコネクタを接続します。
9. チューブに取り付けられたコネクタと出口チャネルを接続します。フロースルーを収集するために皿または15ミリリットルコニカルチューブにチューブを入れる。
10. infusiを開始10μL/分でマイクロスライドを通して上。内皮細胞間の相互作用を観察し、MDA細胞またはエピ蛍光顕微鏡で488 nmのフィルタの下に患者に由来するラベルのCTCのラベル。
11. 30秒の短いビデオなどの実験の記録を開始。再生分析中に、ローリング速度を測定。圧延速度は、経時的に細胞が移動した距離を割ることによって測定される。

ミクロスライドの6。免疫染色

1. 10分間、IL-1βで刺激したHUVECにMDA細胞を灌流した後にマイクロスライドの入口と出口からメディアを取り出します。
2. （37°C）をPBSで5分間、マイクロスライドの入口にカルシウム及びマグネシウムを含有する200μlのチップを用いて、暖かい置く。ベンチで小道具としての蓋を使用してマイクロスライドを傾けます。免疫染色時に全てのインキュベーションのために傾いた位置にマイクロスライドを保管してください。
3. 入口に暖かい、2％ホルムアルデヒドを灌流によってHUVECをを修正しました。
室温で20分間インキュベートする。 5分間ずつPBSで2回すすいでください。
4. RTで10分間PBS中5％BSAにトリトンX-100（0.1％）を添加する。
5. 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 30分間、PBS中の5％BSAでブロックする。
6. 一次抗体ヤギ4℃で2.5％のBSA、O / Nでの抗VE-カドヘリン（1:100）でインキュベート
7. 次の日、5分間ずつPBSで2回洗浄します。 45分間二次ロバ抗ヤギ抗体647を追加します。 5分間ずつPBSで2回洗浄します。
8. 1時間ヒトJ591-のAlexa488結合抗体で、室温でインキュベートする。
9. 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 5分間、DAPIを追加します。 5分間蒸留水で洗ってください。
10. PBSを追加する（または長期保存のためのMowiol）。共焦点顕微鏡下でマイクロスライドを可視化する。

結果

図1に、マイクロスライド上のECの単分子層のO / N培養を示しています。 図1Aにスケーリングはマイクロスライドの100％が70％の10倍の対物レンズ（ 図1B）を使用して表示されている間に5 ​​倍の対物レンズを使用して表示されていることを示しています。 E-セレクチン介在性相互作用のため、エッジにローリング細胞は録画と再生の分析のためのマイク?...

ディスカッション

による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。

血液細胞のう ​​ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02