簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

要約

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

要約

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

概要

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1.胚の準備

1. 胚培養、pH8.0の固定前⁸に2.5％のシステインを使用して、デゼリー胚の一部として日常的に行われていない場合。それは絶対に必要ではありませんが、手動で微鉗子を用いて固定前に受精エンベロープを削除するには、それが便利です。
   1. 胚を転送するためにガラスパスツールピペットを使用してください。ピペットはそう胚をピックアップするのに十分な幅の点でガラスピペットをカットするダイヤモンドペンを使って胚を転送するのに十分な幅ではありません。シャープなエッジを溶融するために迅速にブンゼンバーナーの炎を通してカットチップを渡すことで、切断した後、ピペットのシャープなエッジを排除します。
      注：ガラスはまだそれが目視で冷却されているように見えても火傷を引き起こすのに十分熱くなっていることなどの注意が必要がある。
2. 段階的に胚の固定を実行します。まず、胚固定で使用するためのガラスバイアルを準備します。最終含むすべてのステップのためにこれらのバイアルを使用してくださいストレージ。プロセスのすべてのステップの間、胚を監視するためにできるように、ふたに優れたテフロンシール付きクリアされているバイアルを使用してください。恒久的なマーカーを使用して、適切な実験情報とバイアルにラベルを付け、その後にも恒久的なマーカーによるアルコールおよび他の溶媒の使用手順の過程で失われてしまうように、明確なテープでラベルをカバーしています。
   1. 胚を修正するMempfaを使用してください。一度に50〜100ミリリットルのバッチで8％パラホルムアルデヒドの株式を行います。溶液中にホルムアルデヒドを得るために必要とされる50〜60℃に必要なH ₂ Oと熱の約75％を使用してください。
      注：このソリューションは、それがホルムアルデヒドではなく、パラホルムアルデヒドを利用していることにMemfa古い公開されたプロトコルのバージョンで使用されるよりも若干異なります。
   2. 10N NaOHを2〜3滴を追加したり、pHが約7.5（使用pH試験紙pHをチェックする）である。パラホルムアルデヒドは毒性が非常に強いので、ヒュームフード内原液を生成する。パラ一度ホルムアルデヒドは、新鮮な容器の中にワットマン紙を通して溶液を濾過し、最終体積にH ₂ Oを追加し、溶液中にある。必要に応じて、1〜2週間、4℃でパラホルムアルデヒド溶液を保存する。
   3. Mempfaの固定液（ 表1）の残りのコンポーネントを組み立てます。パラホルムアルデヒドの最終的な作業濃度は4％であることを確認してください。ストックとして4℃で固定液のすべてのコンポーネントを格納します。
   4. カットガラスピペットを用いて、Mempfa溶液（ 表1）の約3~4 mlの満たされた標識されたガラスバイアルに胚を追加することによって、胚を固定する。バイアルあたり以上の20〜30の胚を固定しないでください。胚培地から液体転送を最小限に抑えて胚を追加します。室温で2時間または4℃で一晩のためにMempfa溶液中の胚を固定してください。
   5. 後半内胚葉構造については、手動で孤立した腸および内胚葉デリバティブ^9,10に原位置で行う、プローブの良好な浸透を可能にし、また空洞染色を回避する。
   6. -20℃で100％メタノールの溶液を保管してください。パラホルムアルデヒド固定した後、約4ミリリットル-20℃で、胚を保存するための100％メタノールとMempfa液を交換する。
   7. ガラスまたは他の胚に付着胚を防止するためにメタノールを添加した後、バイアルを旋回させる。また、緩い場合、メタノールは時間をかけて冷凍庫で蒸発することができるので、バイアルを密封していることを確認してください。
      注：胚のin situハイブリダイゼーションの品質を損なうことなく、染色の前にメタノール中で、おそらく長い少なくとも1年間保管することができる。

2.プローブの準備

1. ジゴキシゲニン標識プローブを作るために鋳型DNAの1〜2μgのを使用してください。股関節のための適当な制限酵素で目的の遺伝子の5 '末端に適当なDNA配列を含むプラスミドをカットアンチセンスプローブを生成するためにトンベクター。
   注：このプラスミドは、適切なRNAポリメラーゼ結合部位（ 例えば、T7、T3、またはSP6）を有するべきである。
2. DNA、水、NTPミックスおよびポリメラーゼ緩衝液がプローブ合成反応を組み立てる前に室温に温める。 表2に記載されている順序での1.5mlマイクロ遠心チューブにRNA合成反応の成分を加える。水の量を調節することは、20μlのプローブ合成反応の全量を添加した。ポリメラーゼ緩衝液の成分が高濃度と寒いとき、テンプレートDNAを沈殿させることができるので、室温で反応を組み立てる。
3. 37℃で2時間転写反応をインキュベートする。
   注：2時間よりも少し長いのインキュベーションは悪影響なしにつながるだけでなく、少し収量の増加を示している。 1時間インキュベートした場合、収率は減少したが、良好なプローブを作ることが依然として十分であろう。
   1. 仕上げに転写反応を待っている間、プローブの品質をテストするために使用されるアガロースゲルを作る。 1×TAE緩衝液100ml中のアガロースを1μgを溶融沸点まで溶液を加熱することにより（ 表1参照）。アガロース粉末が完全に溶解したときに熱からソリューションを削除します。
   2. アガロースは、紫外線（UV）光下でRNAの可視化を可能にするために約60℃に冷却したときに、約100mlのアガロースゲルを2μlのエチジウムブロミドストック溶液（10mg / ml）を加える。
      注：将来のゲルを繰り返し溶融することなく注ぐことができるように、このアガロースゲル溶液を60℃のインキュベーター中に保持することができる。潜在的な毒性によるエチジウムブロマイドの取り扱いに注意してください。
4. テンプレートDNAを除去するために37℃でさらに10分間、2時間のインキュベーション後に転写反応に1μlのDNアーゼI（RNアーゼフリーグレード）を添加し、インキュベートする。
5. に反応ミックス1μlのを削除TEバッファー（10 mMトリスpH8.0,1mMのEDTA）、5M NH ₄アセテート10μlの、そして220μlの1％SDSの80μlを添加する1％アガロースTAEゲルで、残り（20μL）に確認してください冷エタノールの。ボルテックスで激しく混合し、RNAの品質チェックの結果が判明するまで氷上に取っておく。
   1. 1％アガロースTAEゲル上での析出する前に除去RNAの1μlのを実行します。ゲル上にロードを容易にするために、RNAへの水の4-5μLと標準ローディング色素の1μlを添加する。 （説明を参照してください）​​、プローブの品質をチェックするために、UV光トランスイルミを用いてゲル上でRNAを表示します。
6. 10から15分間フルスピードで微量紡糸してステップ2.5で氷の上に放置した残りのRNAを沈殿さ。引き出されたガラスピペットで上清を描画し、簡単に乾燥させます。
   1. エッペンドルフチューブ中のRNAハイブリダイゼーション緩衝液1ml（ 表1）を用いてプローブを再懸濁する。ボルテックスとBRiefly再び37℃、ボルテックスにチューブを加熱する。 15mlをキャップポリスチレンスクリュー管にプローブ溶液を移し、RNAハイブリダイゼーション緩衝液7-10 mlに満たす。注：プローブは、多くの場合、低バックグラウンドで結果が、染色反応にも時間がかかります（10倍、さらに希釈がまだ働くことができる）をさらに希釈することができる。

in situハイブリダイゼーション 3.

1. -20℃のメタノール中で保存した胚を取り、室温に温める。ガラスバイアルに全体の手順を実行します。 1グループとは異なる胚が異なるプローブによって見しようとしている場合は、プローブは初日にばらつきや労力を軽減するために追加される直前まで単一バイアルに保管してください。
   1. 表3に概説されるように、プローブの添加のための調製において（洗浄レシピについては表1を参照）のメタノール一連の胚を再水和する。静かにエンブリーを旋回各変更後のOSは、彼らが側面またはお互いに付着していないことを確認し、旋回装置にバイアルを装着することにより胚を岩に。液体を転送する場合、胚がそこに閉じ込められていないことを確実にするためにキャップの内部を確認してください。
   2. 表3に記載したように、一度プローブ溶液で、一晩胚をハイブリダイズする。
2. プローブ溶液を除去します。 15mlに格納することによって使用されるプローブを保存は-20℃での日付とプローブが使用された回数でマークキャップポリスチレンチューブを、スクリュー。
   NOTE：比色反応は、所望の強度を達成するために異常に長い時間がかかり始めるまで同じプローブはin situハイブリダイゼーション 、その後のために何度も再利用することができる。
   1. プローブが除去されると、 表4に概説する一連の洗浄を通してプローブに対する抗体染色のための胚を準備する。トンを移動させることである（ 表4）必要に応じて温度を変更する彼旋回装置、直接適切な温度に設定されているハイブリダイゼーションオーブンに、添付の胚のバイアルと。
   2. 抗体の前に添加することによってブロックされるように、胚は、ブロッキング溶液MAB + HTSS + BR中でインキュベートされた時点でMAB + HTSS + BR +抗DIG抗体（ 表4）の適切なボリュームを構成する胚。利用当日の阻止ソリューションは新鮮なことを確認します。
3. 抗体溶液を除去し、抗体と一晩インキュベーションし下記の表5に概説されるように洗浄をし始める。アルカリホスファターゼ基質を染色するための準備を可能な限りバックグラウンドを低減するために、少なくとも12の30分間の洗浄を行う。 MABバッファまたは洗浄ステップのためのTBT溶液（ 表1）のいずれかを使用してください。
   NOTE：TBT溶液はBSAの2ミ​​リグラム/ミリリットルを加えたことTTWある。
   1. BMパープルアルカリホスファターゼ基質との最後の洗浄溶液を交換してください。染色REACを実行します室温または37℃のいずれかでる。
      注：染色は、37℃で、より迅速であるが、一晩放置した場合、許容できないバックグラウンド染色は、多くの場合の結果であり得る。染色反応は、多くの場合、一晩染色し、室温がこのための最も安全である必要があります。
   2. さらに染色が必要であるとBM紫色の溶液が青色に取っている場合は、新鮮なBMパープルに染色液を交換し、37℃Cにチューブを入れる。標的mRNAが非常に豊富である場合は、4℃で一晩染色溶液中で胚を配置し、染色反応をより良くモニタリングを可能にするために、室温または37℃に胚を移動する。
   3. 最終結果までの時間が異なる標的RNAとの間でかなり変化するように、慎重に新しい反応を監視します。一貫性を保つため、より長いインキュベーションで生じる表現の新たなサイトが存在しない場合（3.4を参照）染​​色反応を停止します。重要なことは、in situハイブリダイゼーションした場合は、アッセイとして使用されている異なる治療群見実験のため、治療群と対照胚との間の呈色反応のために同じ時間を使用する。
4. 染色反応を停止し、 表6に概説されているような液体を変更することで、ストレージと画像記録のための胚を準備する。汚れの除去は、胚の周りのメタノールの紫色の着色として可視化することができるので、この段階での胚を揺するしないでください。
   注：これは重いバックグラウンドまたは空洞染色を除去するのに十分ではないが、多くの場合、胚は、染色溶液及び少なくとも部分的にそれを削除することができ、冷メタノールからの光ブルー染色を持つ。冷メタノールで-20°Cの冷凍庫内に維持されるメタノールを指す。
   1. 胚を再水和とMempfa（ 表6）で汚れを固定します。固定後、Mempfaを除去し、25％メタノールで胚を洗浄する。
   2. 25％のメタノールを除去し、内因性顔料の除去場合に漂白液を追加必要とされている。それは火傷の原因となりますので漂白液の取り扱いに注意してください。それは比較的迅速に発生し、漂白の程度は異なる効果（ 図2）のために変化させることができるように密接に漂白を観察します。
   3. （ 表6参照）漂白以下の長期保存のために100％メタノールをメタノール一連の胚を脱水、または短期記憶およびその後のイメージングのためにPBSに移す。

4.イメージング胚

1. 胚は、染色処理を完了すると、画像は、胚、目的の遺伝子が発現される場所に関する情報がより多くの人のために捕捉されるようになっている。未確認の胚を表示するには、背景としてアガロース1％を使用してください。
   注：アガロースが胚および染色反応の青色とよく対照的でブルー/グレーの背景を提供します。また、胚から注意をそらす気が散る影や反射を拡散させるのに役立ちます。
   1. 水にアガロース追加し、アガロースが溶液中になるまで沸騰させると、その後ペトリ皿に注ぐ前に50に冷ます。 TAEゲル溶液と同様に、複数の用途のために55℃のインキュベーター中でアガロース溶液を保存する。シャーレに約2ミリメートルの深さまでアガロースを注ぐ。必要に応じて、バックグラウンドの若干異なる色合いを得るためにアガロースの深さを調整。
   2. 水溶液（PBSまたはTTW）に、メタノール中のストレージから再水和した後、メタノール系を用いて、（ 表6参照）アガロースベースとペトリ皿に胚を置く。きれいなソリューションを保持し、必要であれば、良好な画像のきれいな背景が中断する可能性が小さな粒子状物質を除去するために単純なフィルタリングを使用しています。
   3. 画像にそのような腹側からのような代替ビューから胚は、 図3の細かい鉗子を使用して胚にフィットし、（オリエンテーションのためにこれらのチャネルに胚を配置するためにアガロースに薄いチャンネルをカット）。彼らは簡単に破損しているように胚を操作する際には注意してください。
      注：ほとんどのステージは、溶液中に置かれたとき、彼らが前提と特徴位置を持っている。例えば、胞胚段階の胚は動物の側を上に座ってする傾向がある。胚が細長くし始めたら、彼らは彼らの側に横たわっていた。
2. 画像に奥行きを与え、表面構造を見分ける助け胚に影を作る、浅い角度から胚を照明するための光ファイバ光源を用いる。漂白は便利なランドマークを提供顔料を、排除することができますので、強く漂白胚についてシャドーイングを使用します。
3. そのような脳、（ 図4）の脊索、肺、または地域のように、深い胚内にある画像の染色に胚をクリアします。これを達成するために、100％メタノール中になるまでメタノールを一連の胚を置く。
   1. メタノールにおける完全浸漬した後、一部のベンジルアルコールの溶液に胚を転送する2つの部分のベンジルであるnzoate（BABB）。胚は、最初に表面に浮くが、メタノールがBABBと混合するように、彼らはBABBに沈んでしまう。ガラスバイアルまたは皿でBABBを扱うすべてのステップを実行します。 BABBは任意のプラスチックや塗料を溶かすします。
   2. 一度クリアされ、透過光が胚の下から来るとの胚を表示します。コントラストを改善し、最良の色を提供するために、下から光の強度ならびに角度を調整する。
   3. クリア胚を表示しているときにベースのオフガラスシャーレを上げる。単に胚と皿の領域が上昇しているように、それを高めるために他の二つのペトリ皿の蓋を使用して行います。
      注：これは、焦点が外れベースを取得し、画像を妨害し得る顕微鏡ベース上の欠陥や汚れから邪魔影響を排除するという利点を有する。

in situハイブリダイゼーション 5.ダブル

1. 同時にTWの発現パターンを表示するには単一胚における異なる遺伝子oを、二つのプローブ、異なる遺伝子のそれぞれについて1つの合成。上記のように標識としてDIG-11-UTPを用いて一つのプローブを合成する。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
   1. DIGはDIG-11-UTPの代わりにする必要があり、そのフルオレセイン-12-UTPを除いてプローブ標識されたと同じプロトコルを使用して、関心のある他のプローブを合成。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
   2. 1：1の比率で2濃プローブを混ぜる。最良の結果を得るには、in situハイブリダイゼーションプロトコルでのシングル最強発現を示す遺伝子のためのフルオレセイン標識プローブを使用しています。
2. in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて同じを使用の<インサイチュで単について記載in situハイブリダイゼーションプローブ、 単一の代わりに最初の日の終わりに、二重プローブ（ジゴキシゲニン標識およびフルオレセイン標識プローブの1.5倍濃縮された混合物を含有するプローブ）を使用して除く/ em>のハイブリダイゼーション、。
   1. 抗DIG-AP Fab断片の代わりに4000希釈、1：抗フルオレセイン-AP Fab断片を使用して除いて、in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて二重の二日目に単一のハイブリダイゼーションプロトコールに従う。 インサイチュプロトコルにおける単一のように胚から過剰な抗体を洗い流し、BMパープルAP基質を用いて第一の色反応を行う。
3. 最初の呈色反応に続いて、MABで5~10分間の洗浄、続いて40分間、0.1 MグリシンpHを2.0にフルオレセイン抗体を不活性化する。 90分間MAB + HTSS + BRで胚をブロックします。 1での抗DIG抗体を追加します。MAB + HTSS + BR 2,000希釈し、4℃で一晩インキュベートする。
   1. 次の日、胚目を洗うoroughly MAB（30分の12回の洗浄）の過剰な抗体を除去する。
   2. APバッファー（ 表1）に10分間の胚を洗浄した後BCIP（APバッファでは0.5mg / ml）で染色する。
      注： 現場の組み合わせの最初の色反応および第二（ 図5）のためのライトブルー色反応のための濃い青紫色の染みを与える必要があります。
   3. APバッファーを除去することによって、最終的な呈色反応を停止させ、MABで三回すすぐ。 10分間Mempfaとの胚を固定してください。 MABまたはTBTで5クイック回の洗浄で胚を洗浄する。
   4. それはBCIP色だけを排除するように、この色の組み合わせでは、ポスト染色治療中のメタノールの使用は、もはや不可能である。 0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS中で染色し、固定後胚を保管してください。強度の染色は、 原位置で二重に弱いことができます。これが問題である場合、4つの2時間の持続時間の各洗浄を減らす。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

組織特異的プローブの使用は、特定の臓器の開発の状態に関してで優れた情報を提供することができる。以下の例では、胚のステージはNieuwkoopとフェーバーステージング表¹¹に基づいています。 1プローブを使用している場合、私は例（ 図1C）のために、段階28-30で、 心筋トロポニンの分化後に発現する遺伝子を形成し、差別化器官の存在又は大きさはどの?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

特定の遺伝子の発現パターンを可視化するために、in situハイブリダイゼーションを使用する能力は、 アフリカツメガエル胚の特定の器官または細胞型を同定するための最も一般的に使用される方法のままである。これは、この技術によって提供されるいくつかの利点がある。遺伝子の発現は、これらのセル¹⁸のいずれかの明確な境界の前に心臓前駆細胞における<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500