マウスにおける超音波ガイド下経胸壁心筋内注射

要約

心エコーガイド下経皮的心筋内注入は、マウスの心臓への遺伝子導入剤又は細胞の送達のための、効率的で信頼性が高く、標的可能なモダリティを表しています。このプロトコルで説明されている手順に続いて、オペレータは、すぐにこの汎用性、低侵襲性技術で有能になることができます。

要約

心血管疾患のマウスモデルは、病態生理学的メカニズムを調査し、潜在的な再生治療を探索するのに重要である。心筋の注入を含む実験は、現在、開胸を通じて直接外科的アクセスによって実行されます。そのような冠動脈結紮などの別の実験操作時に行う際に便利な一方で、心筋内送達のための侵襲的処置の必要性が潜在的な実験デザインを制限します。これまでの超音波の解像度と、高度な非侵襲イメージングモダリティを改善すると、それは日常的に超音波ガイド下、経皮的心筋内注射を行うことが今や可能である。この様式は、効率的かつ確実に心筋の標的領域にエージェントを提供します。この技術の利点は、外科的罹患率の回避、選択的に超音波ガイド下心筋の領域を標的とする機能、およびmyocardiuに注入液を送達する機会を含む複数、所定の時間間隔でmである。練習技術では、心筋内注射による合併症はまれであり、マウスはすぐに麻酔からの回復に通常の活動に戻る。このプロトコルで説明されている手順に続いて、基本的な心エコー検査の経験を持つオペレータは、すぐにこの汎用性、低侵襲性技術で有能になることができます。

概要

心臓病は、毎年60万死者¹を占め、米国の男性と女性の両方のための主要な死亡原因である。心血管疾患のマウスモデルは、病態生理学的メカニズムを調査するため、潜在的な治療法を探索するのに非常に重要である。遺伝子治療ベクターの心筋送達、幹細胞は、修飾RNA、および他の治療剤は、心臓病^2-7に対するそれらの治療可能性の調査を可能にする。現在、マウスモデル⁶における治療薬の心筋の送達のための限られた選択肢があります。直接可視化の下で心筋注射が一般的に使用されますが、胸骨切開または開胸術を必要とし、心臓の露出領域に限定されているされている。そのようなLAD結紮などの別の実験操作時に行う際に便利な一方で、心筋内送達のための侵襲的処置の必要性が潜在的な実験デザインを制限し、紹介する手順（開胸術によるもので、 例えば線維症）からdditional効果。ウイルスベクターの経皮的心膜送達が報告されているが、サイトおよび治療 ​​剤の分布は均一ではなく、コントロール⁸に困難である。注入された材料のより均一な分布における経皮的冠動脈注入の結果が、効率的で再現性の冠動脈配信マウスモデルにおいて困難である。

ここでは、超音波ガイド下の治療薬の低侵襲性、オペレータ制御されたターゲティングを可能にする、閉じた胸の心筋内注入技術について説明します。技術は習得が容易で、開胸や胸骨切開とそれらに付随する実験的な合併症を不要、タイミングや心筋内注射部位に大きな柔軟性を提供します。このように、心エコー検査補助心筋内注入は、操作する技術的に簡単かつ非常に効果的な方法を示し、マウス実験モデルにおいて心筋。

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プロトコル

すべての説明する手順は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。

の調製

1. 心筋内注射のための最適な固定トランスデューサ位置が解剖学と機能の評価の輪郭を描くための最適な標準のビューを得られない可能性がある、以前の注入プロトコルを開始する心エコー検査によるベースライン心臓解剖学的および機能評価を行います。
2. 注入のセットアップは、 図1A〜1Cに示されている。シリンジクランプで、ベベル指向上向き、シース針を空のシリンジを置きます（ 図1Cを参照）、（ 図1Bを参照）スキャンヘッドクランプに超音波トランスデューサ·プローブを固定します。スキャンヘッドクランプボールロックジョイント（ 図1B）をゆるめ、それが針の軸に平行に位置合わせされるように、変換器の向きを操作する。スキャを修正スキャンヘッドクランプボールロックジョイントを締めてヘッド位置。
   注：成体マウスでの注射のために、1 / 2.5cmの長さが30のGの針が最適である。気密シリンジより少量（5〜10μl）をより正確に制御するために使用することができながら、1mlシリンジは、より大きな体積のために使用することができる。
3. その全てに沿って頭をカバーするためにスパチュラでトランスデューサ先端に自由に超音波ゲルを適用します。慎重に針を鞘から抜くと針を直接変換器の下と可視化のための超音波ゲル内に針を前進させるためにコントロールをマウントしてください。針、針が超音波画像上でその長さに沿って明確に可視化されるように制御をマウントを使用して微調整を行います。トランスデューサが適切にステップ1.4において、針に平行に整列された場合は、前進及び噴射制御ノブ（ 図1C）に引き出されるように、次いで、針は、撮像面内にとどまるべきである。
4. その後の工程では、必要性を乱すことがありません横軸のいずれかに移動させることにより、LE /トランスデューサ水平方向の配置。むしろ、マウント針の垂直（y軸）の位置を変更することにより、動物のプラットフォームを移動させることにより、注射用心臓の特定の領域を標的とする。
5. 動物プラットフォームに、麻酔したマウスのその後の配置を可能にするためにスキャン高さ制御（ 図1B）を用いて動物プラットフォームから上方にトランスデューサを移動します。これは、針の長軸にトランスデューサのx軸の位置合わせは中断されません。
6. シリンジクランプから位置合わせに使用した注射器を取り外し、慎重に捨てる。シリンジチップにデッドスペースを可能にし、最終的なターゲットボリュームへの注入物を使用して新しい針と注射器をロードします。気泡を除去するように注意してください。そのx軸アライメントを調整することなく、シリンジクランプに注射器を置きます。完全噴射制御を使用して注射器を後退させる。
   注：初期トレーニングのために、エバンスブルーの使用染料（1％）、トリパンブルー染色（0.4％）、または注入液のような蛍光マイクロスフェアの懸濁液をコンピテンシーと目標と注射の成功を確認したオペレータを支援することができます。

2インジェクション

1. 加熱プラットフォームの統合ウォーマーの電源を入れ、37℃のためにそれを設定してください。麻酔ホースクランプ、オペレータに最も近い動物の頭で、通常の画像形成の向きから、動物のプラットホームを180°に配置します。これは（胸の左側にある）の心は、シリンジクランプと針と同側にすることができます。注：動物プラットフォームに追加のマイナー時計回りの回転調整は注射（ 図2A）のために使用される胸骨傍短軸像面に対して正しく心を配向する必要があるかもしれない。
2. 以前に^9を報告したように心エコー検査のためにマウスを準備します。 2％のイソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。脱毛クリームのANと胸毛を削除する強膜の乾燥を防ぐために両眼にゲルを適用する潤滑dは。
3. スキャンヘッド高さ制御（ 図1B）を使用して、変換器を持ち上げます。 1〜3％イソフルラン（ 図2A-2B）を配信ノーズコーン内の鼻で加熱動物プラットフォームの上に、麻酔したマウスの仰臥位を置きます。ゆっくりと直腸プローブを挿入し、電気的に接触するための電極ゲルを適用し、ECG電極に4本の足をテープで固定します。
   注：麻酔の適切なレベルは、動物の人道的な扱いのために確保されなければならない。心拍数に変化し、胸壁を通して針の配置に無応答でなければなりません。低体温症は相対徐脈、心室拡張、および可能な不快感になりますように、動物のプラットフォームの統合された恒常性、温度コントロールは、正常体温（37±0.5℃）を維持するために使用されるべきである。
4. マウスは、動物のプラットフォーム上で安全であると、depila上にトランスデューサを下げるテッド胸部スキャンヘッド高さ制御（ 図1B）を使用して。心臓が標準の心エコー手法に従って、胸骨傍短軸方向で可視化されるために、注射のための最適な超音波のセットアップがある。を20-30°動物プラットフォームを回転させるには短軸像面内の注入のための最適な音響窓（ 図2A-2B）を得るために時計回り。注：あるいは、注入は、動物のプラットフォーム（ 図2C）の反時計回りの回転によって胸骨傍長軸の向きから行うことができる。
5. 視野を調整するために、左心室の心筋内の任意の所望の注射部位を標的とする動物プラットフォーム調整コントロールを使用する。左心室の心筋（ 図3A-3C）内の所望の噴射位置を標的とするために、心臓のベース頂部から前後パン。注：midpapillary胸骨傍短軸（ 図3A）が reproduciblを提供しています注射部位のフォローイメージングを可能にする電子ランドマーク。注意：代替的に、胸骨傍長軸ビューは、事前定義された注入部位（ 図3D）を標的化するために使用することができる。
6. 完全に後退したシリンジクランプで注射器から始めて、ゆっくりと噴射制御を時計回り（ 図4A）を回して、動物の胸に向けて注射器を前進させる。それは胸に近づくにつれて、心臓と針の先端の両方の明確な超音波可視化を可能にするには、胸の左側の上に超音波ゲルをたっぷり使用し、心エコーコントロールで広い視野を設定することで、音響窓を最適化します。注射のための標的部位での焦点/ゾーンを設定します。針の微調整は、コントロールは、その長さに沿って針の画像を最適化することができますマウント。
   注：一部の超音波装置は、デジタルターゲット心筋へ通る針の長軸に沿った線を延長するニードルガイドソフトウェア機能を有している（ 図4B）。このようなソフトウェアツールが役立ちますが、必須ではないことができます。
7. 動物は適切に鎮静させて、慎重に全くベベル針の先端の位置を観察し、マウスの胸壁を通って心筋に針を前進させる（1〜3％イソフルラン0.5〜0.8 L /分で100％酸素と混合）回。針の先端がターゲット心筋（ 図4C）内にあるときに前進を停止する。全体ベベル先端が心膜腔に注入液漏れを避けるために、しっかりと心筋内になければならない。
8. 先端が目的の位置にあるとき、シリンジプランジャを押すことにより、注入物をお届けします。 5-30秒かけて、ゆっくりと注入液を配信（音量に応じて配信されている）。注入液を50μlまでの心室機能を損なうことなく送達することができる。注入された心筋領域への過渡echobright外観が成功し、注射後明らかであろう。相対bradycardの簡単な（秒）の期間iaが時折心筋への注入に留意し、迅速に解決されている。
9. 注入液を投与された後、速やかに噴射制御ノブの反時計回りの回転によって針を引き抜く。マウスは保存心室機能なしpostprocedural合併症を確認するために、心エコー観察の数分間麻酔下で維持されるべきである。示された場合は、心筋の複数の領域を連続動物プラットフォームの調整によってアプローチの針の角度の再配置によって注入することができる。心筋内注射後、マウスは、それ自身のケージに入れ、観察下に麻酔から回復させる。
10. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に心筋内注射を受けた動物を返さないでください。ケージは、再を恒温パッド上に配置する必要があります水とマウスの食事のADY規定。 Postprocedural不快感が期待されておらず、障害が適切に（説明を参照）介入は潜在的な合併症を示唆した直後に通常の動作を再開すること。
11. 慎重に作業者や近くに鋭利器材損傷のリスクを最小限に抑えるために、すぐに心筋内注入が完了した後に針を捨てる。針を再利用することをより困難な心筋を貫通するようになっ先端の鈍化や合併症のリスクが高い、その結果をもたらす可能性がある。

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結果

青色染料または蛍光マイクロスフェアとマウス心筋内注射

エバンスブルー色素の注入は、トレーニング目的のために有用である。すぐに注射した後、注入された青色色素の位置を可視化するために、マウスを安楽死させると心臓を取り外します。 図5は、青色色素半ば乳頭筋レベル（ 図5A、囲まれた領域での心筋浸潤して、成功した注入の例を示し...

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ディスカッション

生物製剤は、血流を介して、直接心筋内注射、心膜内注射、または間接的な投与により心筋に送達することができる。心筋梗塞モデルにおける最近の細胞ベースの治療試験は、注入物^12〜14の配信に開放開胸アプローチを記載している。心筋治療的介入の成功の重要な要因は、配信経路の選択にかかっている。生物学の最も高い局所的投与量は、心筋内デリバリー^15,16によって...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent