の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

要約

ショウジョウバエ胚への小分子の導入は、新規化合物、薬物、および毒素の生物学的活性を特徴づけるだけでなく、根本的な発生経路を探査するための大きな可能性を提供しています。本明細書に記載される方法は、 ショウジョウバエ胚モデルの有用性を拡大し、このアプローチには自然な障壁を克服する手順の概要を説明します。

要約

ショウジョウバエの胚は長い開発を制御する分子および遺伝的メカニズムを解明するための強力な実験室モデルとなっている。このモデルを使って遺伝子操作のしやすさは、他の動物モデルおよび細胞ベースのアッセイでは一般的である薬理学的アプローチを取っています。ここでは、開発ショウジョウバエ胚への小分子の適用を可能にするプロトコルの最近の進歩について説明します。この方法は、胚の生存率を維持しながら、卵殻の不透過性を克服するための手順を詳しく説明します。発達段階の幅広い卵殻の透過性は、溶媒、前述のd-リモネン胚透過化^（1 EPS）を適用することによって、（18℃）の前治療に低温で加齢の胚によって達成される。また、透過性指標として遠赤色色素（CY5）の使用は、標準的な赤と緑のインフルエンザを含む下流のアプリケーションとの互換性がある、記載されているライブや固定製剤におけるorescent染料。このプロトコルは、特徴づけられていない小分子の催奇形性や薬理活性を評価することを目的とした研究のための発達のメカニズムを探るだけでなく、生物活性化合物を用いた研究にも適用可能である。

概要

ショウジョウバエの胚は、開発²の基本的なメカニズムの調査のための最高のモデルであり続けている。この強力なモデルは、任意の時点で、任意の開発器官内、基本的に任意の遺伝子の操作を可能にする分子遺伝学的ツールの幅広いサポートされています。 ショウジョウバエの胚の形態形成の小型化、急速な発展、および大規模な特性評価が基本的な発生経路を^3,4発見されているその多くは遺伝子スクリーニングのための選択のモデルにする。 ショウジョウバエ胚の多数の表現型が特徴づけられ、容易に解釈され、多くの場合、異常な形質の責任を根本的な分子遺伝的メカニズムを識別するための手段を提供してきました。

歴史的には、フライ胚モデルの欠点は、胚組織に小分子を導入することの難しさとなっている。 1）私たち：この障害は、上の制限を提起している発達メカニズムおよび2を尋問するプローブとして、既知の生物活性小分子をING）特徴付けられていない小分子の催奇形性または薬理学的活性を評価するために、この確立されたモデルを使用して。その結果、ハエの胚のスクリーニング電位は、小分子活性の特徴付けに十分に活用されている。

1）卵殻の透過処理および2）マイクロインジェクション：ハエ胚への小分子の送達は、2の方法で達成することができる。この記事では、従来のショウジョウバエの実験室の設定で実行しやすい透過処理する方法にも進歩を提示します。これは、マイクロフルイディクス技術とマイクロインジェクション法の最近の進歩にも胚^5,6に化合物を導入する方法に貢献していることに留意すべきである。胚への分子の導入は卵殻⁷のワックス状の層によって防止される。 ショウジョウバエ卵殻は5層からなる。からインサイドアウト、彼らは以下のとおりです。卵黄膜、ろう状層、内側の絨毛層、endochorionとexochorion ^8。 3個の外絨毛膜層を希漂白剤、dechorionationと呼ぶ工程における胚の簡単な出現によって除去することができる。それは、基礎となる卵黄膜に包まれたままで露出蝋質層は、透過性の絨毛膜を除去し、胚をレンダリングする、例えばヘプタン、オクタン^7,9などの有機溶媒への暴露によって損なわれ得る。しかしながら、これらの溶媒の使用は、胚の生存率^9,10に厳しい負の効果を有し、どちらもそれらの毒性、それらの強力な浸透化作用を調節する上での困難に起因する合併症を導入する。

溶媒組成物と呼ばれる胚の透過化（EPS）を用いて透過化する方法は、以前に^1に記載されている。この溶剤はmisciblする溶媒を有効にd-リモネンおよび植物由来の界面活性剤で構成されています水性緩衝液を使用して電子。 d-リモネンおよび所望の濃度に溶剤を希釈する能力の低毒性は高い生存¹と透過性の胚を生成するための効果的な方法が得られている。しかし、2内因性の要因が、アプリケーションに制限を持って続けてきました。まず、胚は注意が近い発達ステージングを維持するために取られた場合でも、EPS処理後の透過性の不均一性を実証する。第二に、約8時間以上経過した胚は、卵が^11を敷設^した後に発生する卵殻の硬化と一致して、透過性にすることは困難であることが判明している。

ここで説明したEPS法の進歩は、1）固定と免疫染色の手順が実行され、2）>（遅発育の時点で8時間、ステージの胚の透過を可能にされた後でも、ほぼ同じように透過化胚を特定し、分析するのに役立つ12歳以上）。具体的には、遠赤色色素の適用、CY5カルボン酸は、開発中およびホルムアルデヒド固定後胚における持続透過性インジケータとして機能することが記載されている。加えて、18℃で胚を飼育すると、後期段階の胚（ステージ12〜16）の透過を可能にする、EPS敏感な状態で卵殻を維持することが示されている。

これらの進歩は、EPS方法論に前述の制限を克服する。このアプリケーションは、従って、生存率を維持しながら、異なる発達時点で胚にとって関心のある小分子を導入するための手段を研究者に提供する。

プロトコル

1。フライ文化、ソリューション、および胚取り扱い装置の調製

1. ショウジョウバエのケージ文化を準備します。 10cmのぶどう寒天プレートと酵母ペーストのスポットを装備し、人口ケージに所望の歪みの500 +交配ハエを配置します。 25℃の湿度制御インキュベーターでの培養を維持する。注：  ケージの文化は、一貫性の胚敷設パターンを得るためのコンディショニングの一日か二日を必要とする。酵母ペーストでブドウのプレートは、コンディショニングの間、午前中に一度、夜に一度変更されます。
2. EPSを準備します。 37℃での界面活性剤（コカミドDEAおよびエトキシ化アルコール）の温かいソリューションピペット小さな攪拌棒を備えたガラス製シンチレーションバイアルにd-リモネン18mlの。ピペットd-リモネンに1ミリリットル2種の界面活性剤（各々5％の最終濃度）の各。完全に混合し、攪拌棒を取り外します。注：EPSのこのストック溶液を、室温で約2ヶ月に適しています。ソリューション37℃に加温し、完全に使用する前に界面活性剤を可溶化するために旋回されるべきである。彼らは時間をかけていくつかのプラスチックを溶解するようにEPS及びd-リモネンは、ガラス容器に保存されるべきである。
3. 胚dechorionation液、インキュベーション媒体、染料と薬剤溶液を調製する。浅い皿に25ミリリットルのH ₂ O及び場所で漂白剤25ミリリットルを混ぜる。前のレシピ^1,12に従って変更、基本的なインキュベーション培地（MBIM）とMBIM-Tを用意します。シールズを準備し、（材料のリストを参照）、製造業者のプロトコルに従って、M3細胞培養培地およびPBSを歌った。 DMSO中10 mMの濃度で透過性色素のストック溶液を準備します。
4. 胚ハンドリング機器および消耗品を組み立てる。
   1. dechorionationとEPS治療バスケットを用意した（ 図1A参照 ）。細かい鋸歯を有する使い捨ての50mlのポリプロピレン遠心分離/培養チューブ3cmの部​​分を切り落とした。付着した紙やすりでの管部分を擦って溶接面フラッシュを作るベンチトップ面に接続します溶接炎の上筒部の縁を溶融し、ガラス板上にメッシュに押圧することによりナイテックスナイロンメッシュに管部。冷ますと余分なメッシュを切り落とす。注：全くの側面と底面は、各工程での残留漂白剤とEPSのオフを迅速かつ完全なすすぎを可能にします。 溶接工程は、ヒュームフードの下で行われるべきである。
   2. 開発バスケットを準備します。キャップの縁と面一に50ミリリットルの遠心分離/培養管の上部を切断してください。 図1（b）に示すように、リムに沿って中央開口とノッチを切り出してキャップを外し、変更します。メッシュの上やカットオフ管部のねじ山のキャップをねじ込み、余分なメッシュをトリム。注：キャップは60ミリメートル溜めディッシュ（ 図1B '）に配置されたときバルク媒体への拡散を許容リムのノッチが含まれています。
   3. スライドチャンバーの部品を準備します。よりも大きい、DO膜の正方形をカットスライドチャンバー開口部。開口部の内側リップに真空グリースの非常に薄い層を適用します。保持リングとグリースに対してそれをシールする開口部に、DO膜を貼り付けます。近い保持リングに戻ってそれを切断することにより、過剰なDO膜をトリミング。注：スライドチャンバーの仕様はKiehart ら ¹³に記載されていますこのチャンバーは、市販のものではなく、機械工場でカスタム製作を必要とします。

胚の2。ステージング、Dechorionation、およびEPSの治療

1. 時限コレクションによって胚をステージング。午前中のハエ培養ケージに新鮮なブドウ/酵母プレートを設定します。胚は25℃で1時間置くことができるようにするこのプレートを破棄し、25℃で2時間、その後の胚の敷設のために新鮮なぶどう/酵母プレートと交換さらに発達ステージング18℃のインキュベーター内で、このプレートと場所を収集します。注：25°Cでの開発の1時間は、開発の2時間に等しく、18℃での後期胚においてEPS透過性の維持に25℃対18℃でのエージングの効果は、図2に見ることができる。
2. Dechorionation。そっと25℃の水道水と絵筆を使用してメッシュバスケットにブドウのプレートから離れた胚をすすぐ。水道水の穏やかな流れの下で、バスケット内の胚から過剰酵母を洗い流す。 2分間、50％の漂白剤でバスケットを浸す。徹底的に水道水の流れの下で胚を洗浄します。注：静かに断続的にプラスチック製のピペットを用いて、胚に漂白液を噴出。 2分が完了dechorionationのため、通常は十分であるが、このインキュベーション時間は、直接検査によって確認され、それに応じて調整する必要があります。水道水に浸漬したバスケットに絨毛膜を除去した胚を維持したEPSすぐにステップに進みます。
3. EPSトリートメント
   1. それぞれのPBS約10mlで6 60ミリメートルの料理を準備します。 2.925ミリリットルMBIに75μlのEPSを溶解させることにより、EPSの希薄化を準備する旋回した50ミリリットルのガラス製ビーカー中のM（1時40）。注意：この混合物から白色のエマルジョンフォームを。
   2. 拭いラボでメッシュバスケットの底から余分な水分を吸い取る。ビーカー内の希薄後EPSにバスケットを浸し、すぐバスケットの底に、EPS溶液中で胚を分散させるために旋回。 30秒間の動きを旋回し続ける。 NOTE：EPS希釈し、露光時間は、透過性を制御するために変化させることができる。これは、最適のEPS希釈液と処理時間が使用されてハエの株を用いて実験的に確立されることをお勧めします。 60〜90秒の露光時間を増加させると、ステージ12歳以上の胚に有利である。
   3. バスケットを外し、拭いラボ過剰のE​​PSを離れてブロット。 60ミリメートル皿中10mlのPBS中の6連続洗浄を進める。静かに6回の洗浄のそれぞれにPBSで胚を噴出するようにプラスチック製のピペットを使用してください。処理工程を染色し、薬物に進みます。注： EPSは、シンク下に処分することができる。

透過処理胚の3。色素と薬物治療

1. 染料トリートメント
   1. 10 mMのCY5カルボン酸色素* 1.5mlマイクロチューブと混合する渦内MBIM-T（50μM最終濃度）の1ミリリットルの5μlを加える。注：*染料の選択は、下流の分析に依存します。 CY5カルボン酸は、固定および免疫染色を用いて、その後の分析に有効である。ローダミンBは、生きている胚の解析に有用である。ローダミンBの赤色発光、およびその代謝物¹の緑色発光、蛍光を使用して、ダウンストリームのアプリケーションでいくつかの合併症を提示することができます。薬物または毒素は、この段階で治療を開始するか、またはこの段階でパルスに薬物/毒素処理を制限するために、色素溶液に添加することができる。ケアは、MSDSと環境安全基準に従って処理し、薬物および毒素を処分するために注意する必要があります。
   2. ペイントブラシを使用した染料溶液にメッシュバスケットから胚を転送します。チューブに蓋をして確保するために何度反転胚は、色素溶液中に懸濁自由に浮遊。室温で15分間章動ロッカーにチューブを置きます。
   3. 旋回装置からチューブを外し、胚が落ち着くしましょう​​。細かいピペットで染料溶液を除去し、洗浄するMBIM-Tの1ミリリットルと交換してください。完全に胚を再懸濁するためにチューブを反転させる。胚が落ち着くしましょう​​と、さらに3つのMBIM-T洗浄を繰り返します。最終すすぎからすべてMBIM-Tを外し、インキュベーションステップに進みます。
2. 胚発生のインキュベーション
   1. 開発バスケットやスライド室：2室の一方に胚を移す。 NOTE：現像バスケットは、より長い期間の発生に好適である、及びその後の固定および免疫染色の手順が実行される場合に必要とされる。スライドチャンバーは、高解像度タイムラプスイメージングに最適で、短い発達期間（ 例えば 、初期胚のイベント）のために最も効果的である。薬物または毒素は、種々の濃度および胚dで培地に添加することができるevelopmentライブ胚、または標準的な固定および免疫染色のプロトコルを使用してエンドポイントをリアルタイムでモニターすることができる。
   2. バスケットに開発
      1. 70％エタノールで潮吹き、開発バスケットを清掃し、脱イオン水で十分に洗い流し、ふき取りラボで乾燥したブロット。薬物または毒素の所望の濃度で培養培地の6ミリリットルを用意します。メッシュベースの下にいないトラップの気泡をように注意しながら60ミリメートル皿に培地で開発バスケットを置きます。注：二つのメディアが一般的に使用されています。50:50混合物中の一人でMBIM、またはMBIM/M3、後者は長い開発期間のためのより効果的である。
      2. 絵筆でバスケットのベースに表面をメッシュする透過化胚を転送します。静かに周囲のリザーバーからメディアとの胚を噴出。彼らは、メッシュ上の単層になるように絵筆を持つ胚を分散させる。注： 顕微鏡画像に進み、PRの透過性と実行可能性の特性を評価eparation（ステップ4を参照）。
   3. スライドチャンバー内の開発
      1. スライドチャンバーを反転し、開口部の周囲に真空グリースの小さなビーズを適用します。開口部内のDO膜表面に薬物または毒素所望の量の培地を150μLを配置します。注：二つのメディアが一般的に使用されています。50:50混合物中の一人でMBIM、またはMBIM/M3、後者は長い開発期間のためのより効果的である。
      2. 絵筆とメディアの低下に透過化胚を転送します。彼らはドロップ内膜に落ち着くこと胚を分散させる。
      3. それによって、メディアを平らに開口部に25ミリメートルの円形のカバースリップを慎重に適用します。グリースでシールを形成するカバーガラスの周囲に沿ってゆっくりと下に押します。注： （ステップ4を参照）を準備の透過及び生存率の特性を評価するために、イメージングを顕微鏡検査に進みます。

4。Identi透過処理生存胚のfication

1. 透過化胚を特定します。デジタルカメラを備えた顕微鏡を用いて、エピ蛍光下で胚を観察します。固定顕微鏡とカメラの設定を使用して、いくつかのフィールドの（プロファイル卵黄自家蛍光を決定するために、青色の波長の）画像を取得する。
2. 相対蛍光強度に基づいて、胚の透過性を決定する。バスケットを収容し、胚の操作を可能にするために大きな作業距離を有する実体顕微鏡を使用する。顕微鏡は、プログラム可能なXYZステージ、落射蛍光照明とデジタルカメラを搭載する必要があります。画像は後の時点で同じ胚の再評価を可能にするために露出し、各胚の画像のステージの位置パラメータを記録するように注意しながら胚（ 図3に代表的な結果を参照されたい）。注： 色素取り込みのパターンが使用される染料は、露光および胚齢の長さに応じて変化するであろう。幅広い単一の製剤全体の色素取り込みの典型的​​なものであると透過性の度合いの変化を反映している。
3. 実行可​​能な胚を特定します。透過化胚の位置をマーキングした後、室温または25℃で、胚発生を続行顕微鏡にバスケットやスライドチャンバーを返します。青のチャンネル蛍光の下で観察し、以前に同定された透過化胚における卵黄自家蛍光の画像を取得する。卵黄分布の正常な進行に応じて生存率を評価（ランドら ¹及び図3の代表的結果を参照してください）。注： 明視野顕微鏡で観察し、胚の形態学的特徴は、他の生存率を評価するために使用することができる。これは、実行可能性と互換性のある透過性のレベルを確立する各色素や使用ハエの株に実験的に決定することをお勧めします。
4. 透過処理の実行可能な胚における薬物または毒素の効果を評価します。
5. 胚proce上記のプロトコルでssed従来の数が薬物または毒素の曝露後の分析のため準備を整えている。分析の様々なタイプのいくつかは、以下の議論で考慮し、ライブ胚における形態形成の直接観察だけでなく、後固定免疫染色分析が含まれています。これらのアプローチの両方は、遺伝子発現パターンと細胞系譜および形態プロフィールを明らかにする生体色素（ 例えば 、GFP）の使用によって強化される。

結果

胚の取扱い装置は、上記のプロトコルでの操作のための「自家製」デバイスを視覚化を支援するために、図1に描かれている。 図2に見られる結果は、開発の後期段階でEPSによって透過する能力に18℃で胚を飼育の強い効果を示す。この条件は、プロトコールステップ2.1で適用される。典型的には、EPS処理した胚において見られる浸透性の様々なレベルを明らかにする?...

ディスカッション

上記の方法は、広い範囲に渡って発達する小分子治療にアクセス可能な実行可能なショウジョウバエの胚を得るための手段の概要を説明します。この方法は、18℃で胚を高齢化、新規で簡単な調査結果を紹介し、以前は初期胚で見られるのと同じ効力を有する後期胚の透過を可能にします。また、透過性の指標として遠赤色色素CY5カルボン酸の使用は、接尾用途において有効であるこ?...

資料

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