トリパノソーマにおけるRNA編集に対する薬剤をスクリーニングするためのレポーターとして、RNA触媒

要約

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

要約

実質的な進歩は、トリパノソーマにおけるミトコンドリアRNA編集のメカニズムを決定する際になされたものである。同様に、かなりの進歩は、RNA編集を触媒editosome複合体の成分を同定してなされたもの。しかし、これらのタンパク質がどのように連携するか、まだ明らかではない。 editosomeに対するハイスループットスクリーニングから得られた化学化合物は、編集サイクルにおける1つ以上のステップをブロックするか、または影響を及ぼし得る。したがって、新規な化学化合物の同定はeditosome機能およびアセンブリを切開するための貴重な分子プローブを生成する。以前の研究において、 インビトロ編集アッセイは、放射標識RNAを用いて行った。これらのアッセイは、ハイスループット目的のために非効率的で時間のかかる不適当である。ここでは、均質な蛍光ベース「ミックスと測定」RNA編集を監視するためにハンマーヘッドリボザイムのin vitroレポーターアッセイを、提示されている。唯一のRNA編集の結果としてハンマーヘッド型リボザイム蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）オリゴリボヌクレオチド基質は、切断を受ける。これは、順番に、それによって信号を生成するクエンチャーからのフルオロフォアの分離をもたらす。 editosome機能が阻害されると対照的に、蛍光シグナルをクエンチする。これは、 インビトロ RNA編集またはeditosomeの機能を阻害することができる化学物質のハイスループットスクリーニングで監視することが一般的に適用可能であるべきで高感度かつ簡単なアッセイである。

概要

RNA編集、mRNAの転写後修飾のプロセスは、第¹ trypanosomatidsに発見された。それ以来、かなりの作業がトリパノソーマ ^2,3におけるRNA編集のメカニズムを研究してなされた。一連の酵素反応において、editosome、約20のタンパク質のコア複合体は、エネルギー発生の酸化的リン酸化系の複数のコンポーネントのための成熟したミトコンドリアmRNAを作成する。触媒のイベントの順序は、ガイドRNA（gRNAs）によって指示されるように、ヌクレオチド鎖切断、ウリジレート（U）追加や削除、および連結される^4。

コアeditosome複合タンパク質に加えて、補因子の数も^5-7同定されている。これらのタンパク質は、主に独立した複合体にグループ化が見られる。しかし、コアeditosome複合体におけるタンパク質集合の順序や小物とのコア複合体の相互作用パターン複合体は、まだ決定されている。 trypanosomatidsにおけるRNA編集処理をターゲットとすると、そのeditosome複合体の構築と機能を研究する際の補助化学解剖器具を提供することがあります。さらに、いくつかのeditosomeタンパク質に関する機能的研究は、薬剤が^8月12日を対象として、その可能性を示す、様々なライフステージ全体の本質を示している。したがって、editosome見出さの阻害剤はまた、trypanosomatidsに対するリード化合物として作用することができる。トリパノソーマによって引き起こされる疾患に対して、現在利用可能な薬剤は、毒性が非効率的で^13,14高価ですので、これは、タイムリーである。

効率的で便利なin vitroアッセイは、RNA編集をブロックする特異的阻害剤の化学の世界を探求することが必要である。 3つのアッセイが開発されeditosome活動を監視するために使用されている： インビトロ RNA編集アッセイ^15（a） において 、フルラウンド、（b）は、 インビトロ RNA編集アッセイ^16,17 に予め切断されND（C）ハンマーヘッドリボザイム（HHR）ベースのアッセイ^18。最初の2つのアッセイは、放射能の助けを借りて編集された製品（ATPアーゼ6 mRNA）の直接可視化に依存しています。 HHRベースのアッセイは、編集時リボザイムとして動作するようにモデル化されているATPアーゼ6 mRNAの修正版を使用しています。機能的なリボザイムはその後、具体的レポーターとして、放射性標識されたRNA基質を切断する。最近、母子里らは、「ミックスおよび測定」を開発放射性標識RNA基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）基板¹⁹で置換されているRNA編集を監視するために、インビトロレポーターアッセイで HHR系。このアッセイの原理の利点は、（a）は、アクティブリボザイムと基質切断の生産が低量（ すなわち 20μL）で同一チューブ内で同時に発生すると、迅速かつ便利なミックスと分析の指標の一種で、（B ）は、放射性標識物質の使用を回避し、（c）の感度すなわち蛍光マイクロタイタープレート形式で計測、および（d）は高い信号対雑音比によってfforded。このアッセイを用いて、精製されたeditosomeに対する既知のRNA編集リガーゼ阻害剤の効果は^、19を確認した。この実験は、主にTから全体editosomesに対して、RNA編集酵素阻害剤の迅速な同定のためのアッセイを検証ブルーセイ 。

図1は、蛍光ベースのインビトロ RNA編集アッセイでの詳細なステップバイステップの概略図である。このプロトコルは、 インビトロで監視RNA編集のために使用することができるいずれかまたは容易に様々なスケールの化合物ライブラリをスクリーニングするために適合され得る。

プロトコル

以下のプロトコルは、蛍光ベースのRNA編集アッセイを実施するための手順について説明します。アッセイは、96ウェルまたは384ウェルプレートを実験の範囲に応じて、単一PCRチューブで行うことができる。続いて、蛍光シグナルは、適切なリアルタイムPCR検出システムで読み取ることができる。ここでアッセイは、384ウェルプレートの文脈で説明されている。

1。培養T.トリパノソーマ細胞

1. Tの増殖培地を準備しますトリパノソーマプロサイクリック型細胞。培地1Lの場合：
   1. 800ミリリットルミリQ水に25.4グラムSDM-79粉末を溶解。
   2. 10 M NaOHで7.3にNaHCO ₃およびpHを2グラムを加える。
   3. 900ミリリットル、濾過滅菌の最終容量にナノ純水を追加します。
   4. 10％の最終濃度までウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン - ストレプトマイシン溶液及びヘミン（2.5 mg / mlで）を加える（v / v）で、100 U / mlおよび7.5 mg / Lであった。
2. の300ミリリットルを育てる1.5×10 ⁷細胞/ mlの密度に70rpmで振盪em>のトリパノソーマ1.7A野生型（プロサイクリック型）28℃での細胞。注：これは600の編集反応に十分の全タンパク質の約0.5 mgのアクティブeditosomeの3ミリリットルを生成する必要があります。
3. 4℃で10分間、6,000×gの遠心分離により細胞を収穫
4. 冷却したPBSG緩衝液（10mMのNa ₂ HPO _4、10mMのNaH ₂ PO _4、145mMのNaCl、および6 mMグルコース）50mlでペレットを洗浄し、10分間10,000 xgでの遠心分離によって細胞を再度スピンダウン4℃

原油ミトコンドリアの2。分離

注：すべてのステップがeditosome活性を保つために氷の上で、または4℃で行われるべきである。

1. DTE緩衝液（1mMのトリス-HCl、8.0および1mM EDTA）30ml中に回収した細胞を再懸濁する。アップなでる上下氷上に少なくとも10倍の細胞膜を破壊する40ミリリットルの無菌ダウンスホモジナイザー（予備冷却）を使用します。
2. 優先的にミトコンドリアをダウンさせるために、4℃で10分間15800×gで0.25メートル遠心機の最終濃度にホモジネートに、すぐに4.3ミリリットル60％ショ糖（ すなわち 1.75 M W / V）を追加します。
3. STM緩衝液（20mMトリス-HCl、pH8.0、250mMのスクロースおよび2mMのMgCl _2）4.6mlのミトコンドリアペレットを再懸濁。私はそれぞれ0.3mmであり、9 U / mlの、最終濃度を0.1MのCaCl ₂の13.8μlのRNaseフリーのDNaseの4を添加する。氷上で1時間混合物をインキュベートする。
4. 4℃で10分間15,800 xgで遠心I. DNアーゼを不活性化するSTE緩衝液（20mMのTris-HCl pH8.0、250 mMスクロースおよび2mM EDTA）4.6 mlを加え
5. 400溶解緩衝液（10mMのトリス-HCl、pH7.2、10mMのMgCl _2、100mMのKCl、1μg/ mlのペプスタチン、1mMのDTT、および1×完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤）とへの転送中にペレットを再懸濁マイクロチューブ。
6. 10％トリトンX-100、1％aの最終濃度に追加ndはチューブローテーター上、4℃で15分間、溶解物をインキュベートする。
7. 4℃で15分間17000×gで2回遠心分離することにより、ミトコンドリアの溶解液をクリア。クリア上澄みを毎回保持。

3。Editosome精製

1. ミリモルのMg（OAcを含む）20、2×HHE勾配緩衝液（40mMのHEPES pHが7.9を使用して、超遠心分離管中の10 mlの10％〜30％（v / v）の線形グリセロール勾配（ 表1）を注ぐ_2、100mMのKCl、および2 mMのEDTA）および取扱説明書に従うことによって、勾配メーカー。
2. 慎重にグリセロール勾配の上部から溶液500μlを除去し、静かにクリアされ、ミトコンドリア溶解物500μLをロードします。超遠心機を用いて、4℃で6時間178000×gでスピン。
3. 4℃で、勾配の上から下へ順に500μlの画分を収集その後の使用まで-80℃で液体窒素とストアを使用して分画を凍結スナップ。

4。 RNAの準備

1. 3分間90℃で加熱することにより、1:1のモル比でT7プロモーターオリゴヌクレオチド（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）を用いてT7プロモーター配列（ 表2）に相補的な配列を含有し、RTに冷却し、それぞれのDNA鋳型をアニール少なくとも10分間。
2. 取扱説明書に従って、 インビトロ転写キットを用いてRNAを転写する。
3. 7 M尿素染料（7 M尿素、0.05％キシレンCynol、および0.05％ブロモフェノールブルー）を等量加えることで転写反応を停止します。 9％のポリアクリルアミドゲル（10％アクリルアミド、7 M尿素、1X TBE）を変性滅菌フィルター上で実行されます。
4. それぞれのRNAを見つけて切除する短波UVランプでシャドーイング紫外線（UV）を使用します。微量遠心チューブに切り出したゲル片を置き、ゲル溶出緩衝液（20mMトリス-HCl、pH7.5、250mMのNaOAcを、1mMのEDTAおよび0.25％SDS）400μlを添加する。チューブローテーター上で室温で一晩溶出する。
5. PRECI冷100％エタノール1mlを添加し、30分間または-20°Cで一晩-80℃のいずれかでインキュベートすることによって溶出したRNAをpitate。
6. RNAをダウンペレットを4℃で30分間16,000×gで遠心分離、。
7. 75％エタノール1mlでペレットを洗浄。 4℃で20分間16,000 xgで遠心分離
8. 表2に示すように、所望の濃度を達成するのRNaseフリー水で適宜RNAペレットを再懸濁する。

5。蛍光ベースのRNA編集アッセイ

1. 単一反応のため、preA6Rbzやマイクロチューブ内gA6Rbz（1:2.5モル比）の2.5ピコモル（1μL）の1ピコモル（1μl）を組み合わせて、3分間70ºCでインキュベートし、時のために、それが室温で放置少なくとも10分。
2. 一方、1×HHE緩衝液（25mM HEPES pH7.9の、10mMののMg（OAc）として保護_2、50mMのKCl及び10mM EDTA）、1mMの含有校正反応のために、preA6RbzとgA6Rbzことなく、 表3を用いて、マスターミックスを調製ATP、5mMのCaCl _2、トルラ酵母RNA、0.1％トリトンX-100、および精製editosomeの16 ngの/μlの。
3. マスターミックスを完成するためにアニールpreA6RbzとgA6Rbzを追加します。
4. RNaseフリー水（無化合物を有するウェル）または200μMの化学化合物の2液の2液のいずれかを含むウェルにマスターミックス（ 表3）の18μLを分注すると、図5によると、プレート内のコントロールサンプルが含まれています。
5. プレートシーラーでプレートをシールし、気泡を除去するために、下にプレートを回転。 4時間28℃でインキュベートする。
6. 各ウェルにgA6Rbzのライバルの25ピコモル（2μL）を追加します。新鮮なシーラーを置き、下にプレートを回転し、リアルタイムPCR装置の上に置きます。以下の実験をプログラムする：
   ステップ1：5分間85℃;ステップ2：10分間24℃;ステップ3：停止します。
7. 23μLの最終容量に各ウェルに、FRET基質の15ピコモル（1μL）を追加します。新鮮なシーラーでプレートをシール。すぐにプレートを回転し、リアルタイムPCR装置の上に戻って配置します。
8. プログラムは、以下の手順を使用して新しい実験：
   ステップ1：1分間37°C;ステップ2：読み出し;ステップ3：1、40回に進み;ステップ4：停止します。
9. 読書を必要とし、FAMフィルターを選択し、全てのウェルを選択することで設定プレート。入力23μL、ボリュームとファイル名を指定して実行を開始します。
10. 分析のためのバーグラフに傾きをプロットすることによって動力学的測定値を得るために、各ウェル/試料から得られた値の傾きを算出する。 NOTE：運動読取サンプルと背景との間の信号対雑音比を改善する;バックグラウンドサンプルはゼロに近い傾斜を有する場合と同じです。終点の読みはより高いバックグラウンドノイズを有する。

結果

大型画面を設定するために必要な必要な手順を示すために、2〜5がアッセイの品質に関する代表対照実験である図 。これらは、スクリーニングの数日にわたって一貫性のあるアッセイのための、または異なる画面を比較するための不可欠な対照実験である。

蛍光信号対雑音比を評価すること

大規模なセットア?...

ディスカッション

トリパノソーマのRNA編集複合体に対する阻害剤を同定するための新規のハイスループットスクリーニング方法はtrypanosomatidsによって引き起こされる疾患に対抗する創薬のための新しいツールを提供し、提示された。 FRETベースのリボザイムアッセイは広範囲に異なる目的のために^20〜22に使用されている;しかしながら、我々は、RNA編集アクティビティ¹⁹ のインビトロ監?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902