リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置

要約

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

要約

多くの脳関連障害は、それらの病態生理に関与する神経細胞死を持っている。関連する薬剤や下流経路の神経保護または神経毒性作用を研究するためのin vitroモデルの改善は、神経保護/神経毒性の分子機構への洞察を得ることに役立つだろうと、潜在的に医薬品開発を容易にすることができる。しかし、多くの既存のインビトロ毒性アッセイは、主要な制限があります-ほとんどがいない時間経過や効果の動態を観察することができ、単一の時点での神経毒性および神経保護を評価します。また、リアルタイムで神経保護に関与する下流のシグナル伝達経路に関する情報を収集する機会が非常に重要であろう。現在のプロトコルでは、ラベルフリーかつリアルタイムコンディット下の神経細胞株におけるセロトニン2A（5-HT _2Aの）受容体アゴニストの神経保護効果を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の使用を記載インピーダンス測定を用いてイオン。さらに、本発明者らは、第二メッセンジャー経路の阻害剤は、神経保護効果に関与する下流の分子を記述するために使用できることを実証している。また、細胞増殖への影響が観察された神経保護効果に寄与するかどうかを決定するために、この技術の有用性を説明する。システムは、セルのセンサーとして、ウェルの底面上に金微小電極アレイを交互に含んでE-プレートと呼ばれる特殊なマイクロエレクト​​ロニクスプレートを利用する。インピーダンス読み出しは、接着細胞、細胞生存率、形態、および接着の数によって修正される。細胞指数と呼ばれる無次元パラメータは、電気インピーダンス測定値から導出され、セルの状態を表すために使用される。全体的に、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置は、以上に寄与し、リアルタイム、ラベルフリー神経保護及び神経毒性の評価、および第二のメッセンジャー経路の関与の評価を可能にする治療候補を選択するためのin vitroでの潜在的な神経保護化合物の詳細かつ高スループット評価、。

概要

神経細胞死は、多くの脳関連障害¹の病態生理学において重要な役割を果たしている。 体外毒性アッセイにおける信頼性と高スループットの利用可能性は、神経毒性のメカニズムにより良い洞察を得るために、薬剤開発の²中の治療候補としての神経保護分子を選択するのに役立つことが重要です。しかし、最も広く速度論的分割を可能としない単一の時点で神経毒性/神経保護を評価するin vitroで神経毒性assays.They で使用するには多くの制限があります。多くの場合、シグナル伝達経路に干渉し、同じ細胞集団においてさらなる研究を制限することができるラベルまたはプローブを使用し、多くの場合、労働集約的であり、多くの場合、機構的洞察を提供しない。本研究では、リアルタイムで及び下神経細胞株における神経毒性および神経保護を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の有用性を実証無標識効果に関与してセカンドメッセンジャー経路の解析を通って下流のメカニズムへの洞察を提供するための条件や。

以前の研究は、細胞毒性、ならびに標準的な技術^3,4,5,6と比較して細胞株における細胞増殖への影響を決定するために、リアルタイム細胞分析の妥当性を確認した。例えば、良好な相関が基礎的な増殖条件下で、HeLa細胞における³つの異なる毒性パラダイムの後いくつかの時点で、標準的な細胞生存率WST-1アッセイの読み出し及び細胞指数値の間で観察された。細胞指数の測定によって評価し、標準的に使用されるスルホローダミンB（SRB）アッセイ⁴時微小管安定化剤パクリタキセル誘発A549およびMDA-MB-231細胞の増殖および細胞毒性に非常に類似した値を示した。不死化海馬ニューロンの神経細胞株では、HT-22細胞指数測定は能力tの検証されたO広く使用3-（4,5 -ジメチルチアゾール2 -イル）2,5 -ジフェニル-ブロミド（MTT）アッセイ⁵に対する細胞増殖、グルタミン酸細胞毒性および細胞保護作用を検出する。同じ研究において、MTTアッセイの結果とセル·インデックス·測定も汎カスパーゼ阻害剤QVD ⁵によって成長因子欠乏および細胞毒性の救出後の神経前駆細胞の増殖、細胞毒性を測定する際によく相関していた。バンデタニブ（血管内皮成長因子受容体および上皮成長因子受容体阻害剤）をNIH 3T3細胞に誘導される細胞毒性は、細胞指数値またはニュートラルレッド取り込みアッセイ⁶で測定し、同様の結果を示した。

私たちは、最近、セロトニン2Aの神経保護効果を評価するために、リアルタイム細胞分析システムを使用した（5-HT _2A）受容体アゴニスト（±）-2,5 -ジメトキシ-4 -ヨードアンフェタミン塩酸塩神経細胞株における（DOI）（ SK-N-SH細胞）およびセコの関与についてスクリーニングNDメッセンジャー経路観察神経保護⁷上でそれらの化学的阻害の効果をモニタリングを通じて。興味深いことに、5-HT _2A受容体は一般的であり、明確な第二メッセンジャー経路⁸の両方を活性化することができる（DOIとリスリド、それぞれのような）幻覚やnonhallucinogenic両方アゴニストを持っています。

提示技術の利点は、それが、日の過程で細胞生存に対するリアルタイム情報を収集するために関与するセカンドメッセンジャー経路を描写するために、神経保護の増殖効果の寄与の可能性を評価するために、最適な時間を選択することを可能にすることである同じ細胞集団に対する追加のエンドポイント研究のため。現在のプロトコルでのワークフローの概略図が図1に示されている。

プロトコル

の調製

1. 37℃に設定し、組織培養インキュベーター中、5％CO ₂で、リアルタイム細胞分析装置のステーションを配置する。無菌条件下で組織培養フード内のすべての細胞培養処理および薬理学的治療を行う。
2. 注：培養のための標準的な条件と比較して異なる温度設定を必要とする神経細胞株は、それに応じて調整されるべきである。弱い接着細胞株について、E-プレート96のウェルの底の金微小電極と細胞の相互作用を容易にするために、コーティング剤を使用する。
3. 細胞培養治療のための薬理学的化合物の1,000倍ストック溶液（適切な溶媒中の神経保護剤または第二メッセンジャー経路阻害剤 - ジメチルスルホキシドまたは滅菌水）を準備し、-20℃で保管してください。以下の処理は、車両などの溶媒を使用してください。
4. 培養ヒト神経芽細胞腫DMEM / F1におけるSK-N-SH細胞約75％の密度に175cm ^2の表面を有する細胞培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）（増殖培地）を補充した2培地。細胞増殖および細胞毒性に対する応答速度の点で実験との整合性を確認するために、（約10継代の）範囲内の細胞継代数にしてください。低い継代数が好ましい。
5. PBSで付着SK-N-SH細胞層を洗浄し、そして37℃で5分間、0.05％トリプシン-EDTA溶液でトリプシン処理。遠心トリプシンを除去し、5分間170×gで細胞。 10ミリリットルの増殖培地中で細胞を再懸濁。セプター細胞カウンターで細胞を計数し、増殖培地で細胞を希釈して300,000細胞/ mlに細胞数を調整する。

2めっき及びSK-N-SH細胞の増殖

1. E-プレート96の各ウェルに100μlの増殖培地を追加し、平衡化し、室温で組織培養フード内で30分放置する。 E-PLAを挿入37℃のCO ₂インキュベーター内でリアルタイム細胞分析装置局におけるテ96。
2. リアルタイムの細胞分析装置のソフトウェアを起動します。レイアウトページで井戸が実験に含ま選択し、編集ボックスに、細胞型、細胞数、名称および細胞治療のために使用される化学化合物の濃度に関する情報を入力します。
   注：このプロトコルの目的のためには、少なくとも4回の反復がそれぞれの治療のために推奨されている。
3. スケジュールソフトウェア]ページでセルインデックスと各ステップのスイープ間の間隔を測定する掃引回数を選択することで、実験に含まれる「手順」を決定する。ステップ1バックグラウンド測定のために予め決められているので、セル·インデックスの96時間、15分ごとに測定し、設定してステップ2」ステップを追加します」を選択します。
   注：治療のために、高速な反応速度と効果が期待されている、短い間隔でスイープを設定してください。
4. 自動的に所定のステップ1を開始するために[スタート]ボタンをクリックとメディアのバックグラウンドインピーダンスを測定。細胞がウェルに添加されると、この値は自動的に各データポイントでのソフトウェアによって減算される。
5. 増殖培地中300,000細胞/ mlの先にステップ1.5で調製した）細胞懸濁液を使用する。細胞毒性/神経保護研究および細胞増殖研究のために15,000細胞/ウェルに良く30,000細胞/。 E-プレートを取り出し、細胞毒性/神経保護研究のためにウェルあたり100μlの細胞懸濁液を追加し、50μlの細胞懸濁液及び細胞増殖研究のために、ウェルあたり50μlの増殖培地を追加します。ウェルあたりの細胞数は経験的に、各細胞株のために最適化される必要がある。
6. 静かに、細胞のさえメッキ用のE-プレート96を旋回させる。細胞がウェルの底に均等に落ち着く可能にするために、室温で組織培養フード内で30分間、E-プレート96のままにしておきます。
7. リアルタイムの細胞分析装置ステーションにおいて、E-プレート96を挿入し、[スケジュールp上のステップ2を開始時代。ソフトウェアのセル·インデックス·ページ上でプロットページにあるセルの曲線と生セル·インデックス·データを表示することによって、実験を通してセル·インデックス値を監視します。

3血清欠乏

1. 24時間細胞をプレーティングした後、実験を一時停止、リアルタイム細胞分析装置ステーションからのE-プレート96を削除します。最終濃度×200に - DMEM / F12無血清培地で1,000倍ストックからセカンドメッセンジャー阻害剤を希釈する。それぞれの経路を阻害するため、細胞毒性を開始する前に、神経毒性/神経保護への関与で30分間、試験される第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤で細胞を処理する。ステーションに、E-プレート96を返し、実験細胞指数測定を再開します。
2. 30分後、再び実験を一時停止します。ピペット（またはマルチチャンネルピペット）で、E-プレート96のウェルから完全増殖培地を慎重に除去し、接着細胞層を破壊しないように注意しながらウェルの隅にピペットチップのエッジを導くことができる。 200μl/ウェルの無血清DMEM / F12培地（血清欠乏培地）を追加します。細胞の機械的攪拌を最小限にするために細胞培養培地の迅速な交換を確実。
3. 最終濃度×200無血清DMEM / F12培地で1,000倍ストックからそれらの神経保護効果について試験されるべき化合物を希釈する。実験計画に従って各ウェルに彼らの神経保護効果について試験する1μlの化合物および第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤を追加します。
4. 増殖研究のための細胞では培地を変更しないでください。ウェルあたり1μlの治療および増殖培地で培養を継続し、増殖培地中の最終濃度×200に1,000倍の在庫から、試験する化合物を希釈する。
5. 以前に設定した96時間、細胞指数測定と15分ごとに継続して実験を再開します。

4。データAnalysis

1. 神経毒性のために/神経保護データは、「正規化細胞指数」を選択することで、実験間のばらつきを低減し、プロットページの「時間を正規化」するために薬物治療や培地交換前の最後の時点に細胞指数を正常化。
2. 興味のある実験条件のためにプロットページで井戸を強調表示し、正規化された細胞指数曲線をプロットする「追加」をクリックする。 、または時間の関数としての正規化されたセル·インデックス·曲線などのセカンドメッセンジャー阻害の神経毒性/神経保護効果の動態を観察します。
3. 増殖に対する効果は神経保護/神経毒性作用に関与しているかどうかを評価するために、時間の関数として増殖培地中で試験薬物治療のための細胞指数​​曲線を観察します。
4. 結果の統計的評価を開始するために、Excelファイルにセルインデックスソフトウェアのページからすべてのセルインデックス時点の実験情報をエクスポートします
   注：統計分析の最初のステップのp値は、ウェルチのt検定を使用して修正されたMATLABプログラムのセットがsemilogarithmicallyプロットした結果、（補助コードファイルとして提供される）時間スケールに対して反転軸を利用している。これらのプログラムは、全体のリアルタイム細胞分析実験の時間経過にわたってp値の検出を可能にするため、より詳細な統計分析のための時間ポイントの選択を支援する。プログラムの詳細については、補足資料を参照してください。
5. 特定の時点で異なる処理条件の下で細胞指数値の差の統計学的分析のために、エクスポートされたExcelファイルからの各時点での選択セルのインデックス値。統計ソフトウェアを使用してポストホックテストに続いて、分散の一方向または双方向の分析（ANOVA）を用いて選択された時点におけるセルインデックス値を分析する。

結果

血清枯渇は、リアルタイム細胞分析装置で連続的に監視することができる細胞指数値を、減少につながる

細胞への神経毒性刺激が提示された技術と、特定の神経毒性刺激と勉強細胞型に依存するのダイナミクスをリアルタイムで監視することができるセルインデックス値の減少につながる。 図2の増加を示しています細胞SK-N-SH細胞を、プラ...

ディスカッション

現在のプロトコルは、連続してラベルを含まない条件下で神経細胞株における化合物の神経保護/神経毒性作用を評価し、効果に関与するセカンドメッセンジャー経路への洞察を得るために、リアルタイム細胞分析装置の有用性を示す。

細胞毒性及び細胞増殖に対する薬物の効果を研究するためのリアルタイム細胞分析の効用が一般的に認識されていても、唯一のいくつ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate