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要約

線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。

要約

このプロトコルでは、必要な材料を提示し、修正Cを製造するための手順。電子のlegans馴化培地および再生（mCeHR）。また、Cを露出し、順化のためのステップE.上に成長した虫液体培地を無菌にする大腸菌が記載されている。無菌Cを利用し、最終的に、下流の実験虫は、この手順の利点を示す。 Cを分析し、決定する能力虫の栄養要件は、ヘム濃度を変化させて無菌液体培地中の窒素野生型線虫を成長させることによって示された。この手順では、ワームの増殖および発達のための最適濃度を決定するために、または、薬剤治療の毒性効果を決定するために、他の栄養素を複製することができる。野生型線虫の成長に様々なヘム濃度の効果は、定性的な顕微鏡観察を経てTを定量することによって決定した各ヘム濃度に生えワームの彼は数。また、多様な栄養素の濃度の効果は、関心対象の栄養素の変化に応答する蛍光センサーを発現するワームを利用することによってアッセイすることができる。さらに、ワーム多数の容易に微粒子衝撃を用いて、トランスジェニックC.エレガンスの生成のために作製した。

概要

土壌線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）は 、遺伝学からの毒物学の多くの研究に使用される強力なモデル生物である。その1mmの大きさは、4日間の迅速な世代時間、培養の容易さ、および大子孫数の結果として、これらの線虫は、遺伝的および薬理学画面1、2の数で利用されている。研究者は、脊椎動物系において保存分子や経路を同定するために、このワームを利用しています。これらの経路は、細胞死シグナル、加齢や代謝経路、および神経系3-6が含まれています。また、Cの透明性エレガンス直接遺伝子発現パターンおよびタンパク質局在を分析するために可視化することができる蛍光タンパク質レポーターを用いて、トランスジェニック系統の生成を可能にする。

多くの研究では、この線虫線虫成長培地（NGM）プレートを用いて、固体寒天ベースの表面上またはlで培養されるiquid培養は、食料源7,8として大腸菌を播種。これらの細菌の食料源は副産物結果の解釈に影響を与える細菌からの干渉との生化学的および毒物学的研究を混乱することができます。これらの複合効果を回避するために、C.エレガンスは、食物源として細菌を欠いている無菌液体培地で培養することができる。このメディアを使用して、我々は成功し、多くの標準的なCには、高度に同期化されたワームの何百万人を培養しCの差別的に調節された遺伝子のマイクロアレイ解析などの虫プロトコル虫は異なるヘム濃度に暴露し、遺伝子衝撃を使用してトランスジェニックワームの生産。このメディアは、化学的に定義されており、博士エリッククレッグ9によって配合オリジナルレシピから変更されている。 10は 、ここであろう（HRG複数）のようなヘム応答性遺伝子と呼ばれるこのmCeHRメディアを使用して、我々は正常ヘム恒常性に関与する遺伝子を同定したE.を接種NGM寒天プレートを用いる標準的な増殖条件下で可能ではなかった大腸菌 。

このプロトコルでは、Cを導入し、維持するための手順を説明しますE.上に成長した虫無菌mCeHRに大腸菌およびトランスジェニックC.を製造するためのワームを大量に取得するには、この方法を利用して微粒子衝撃を使って虫ライン 。 Cの栄養所要量を決定するための無菌の媒体を使用することの有用性を示す、我々もまた、本研究でエレガンス例としてヘムを用いて。これらの研究は、mCeHR媒体を使用してC.多数の急速な成長を可能にすることを示してワームの研究者によって利用され、多くのダウンストリームアプリケーションのためのエレガンス 。

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プロトコル

1。ワーム株

  1. Cを得E.を接種線虫遺伝学センター（CGC）（http://www.cbs.umn.edu/cgc）から野生ブリストル N2株エレガンスとNGMプレート上でそれらを維持する大腸菌菌株OP50 7。注意：トランスジェニックワームは、以前に11を説明したようにIQ6011（PHRG-1 :: GFP）を利用が生成された株。 IQ6011は、対応する著者から要求することができます。

変更されたCの 2。準備虫居住再生中（mCeHR）

12下記のようmCeHR液体培地を用意します。この無菌液体培地は、ワームが追加の食料源なしで成長することができます。このような層流フードとして、厳密に無菌状態を使用して無菌液体培地および無菌ワームの全ての操作を行う。

  1. 食料品店から超低温殺菌無脂肪牛乳を入手します。冷蔵プロを使うダクトとしない常温製品。 mCeHR媒体、連勝で寒天プレートブレインハートインフュージョン（BHI）に牛乳を使用し、無菌性を確認するために30℃〜37℃で3日間インキュベートする前に。 -80℃で50ミリリットル滅菌チューブおよび格納するために牛乳を転送
  2. 下記の各成分を調製し、順序およびmCeHRの1 Lを調製するために所定量（ 表1A）に結合する：2mMのコリン二酸、クエン酸10mlの、ビタミン及び成長因子の混合物を10ml（ 表1Bのレシピを参照されたい）、 2.4 mMのミオイノシトール、2mMの塩化ヘミン10mlの脱イオン水250mlを10ml。 0.22μmのフィルターユニットを介して吸引し、フィルタを適用します。
  3. 核酸混合物を20ml（ 表1Cにおいてレシピ）、ミネラル混合物を100ml（ 表1Dでレシピ）、170 mg / mlのラクトアルブミン加水分解物20mlを、必須アミノ酸、20mlの非必須アミノ酸、10 mlを加え酸、450mMのKH 2 PO 4、20mlの1.45 M D-グルコース、1 M HEPES 10mlのナトリウム塩を250mlの脱イオン水50ml。
  4. コンポーネントを殺菌フィルタに吸引を適用します。フィルタを削除し、5 mg / mlのコレステロールの1ミリリットルを加える。培地のpHは約6〜6.5であることを確認してください。注：この溶液を最大1年間-80℃で保存することができる。
  5. 使用前にmCeHR培地に20％（v / v）の超低温殺菌された有機スキムミルクを加える。牛乳を開いて小分けするとき（層流フード内など）綿密に無菌技術を使用してください。 4℃で、メディアを格納

3℃に準備無菌mCeHR液体培地中で培養するための虫

  1. 多くの妊娠ワームやOP50 Eの最少量があるまで、10 60ミリメートルNGMプレート上でワームを育てるプレート上の大腸菌 。
  2. M9バッファー（ 表1Fにあるレシピ）5mlでリンスすることにより、各プレートからワームを削除し、50ミリリットルコニカルチューブに結合します。
  3. sにワームを許可する慎重にEを含む上清を除去し、5から10分間放置し、チューブを残すことによってettle 大腸菌 。
  4. 繰り返して手順を続行する前に、可能な限り残留細菌をできるだけ多く除去するために3.2と3.3倍を繰り返します。
  5. 実施例1.5 mlの個々のワームがチューブから見ることができる3 mlまたは6ミリリットルのために、3の倍数である体積の0.1 N NaCl中ワームを再懸濁する。
  6. 5 N NaOHおよび5％次亜塩素酸ナトリウムウォーム懸濁液に午前1時02分06秒の割合で（漂白剤）の溶液を添加することによってワームを漂白する。例えば、1mlの5NのNaOH 2mlの5％次亜塩素酸ナトリウム：ウォーム懸濁液を6ml。ワームの懸濁液に添加する前に、NaOH及び漂白剤を混ぜる。
  7. 渦は、溶液を激しく妊娠ワームが溶解するまでしか卵は懸濁液（約5から10分）内に表示されます。 10倍の対物レンズとの位相差顕微鏡を使用してプロセスを監視します。
  8. ワームが完全に溶解した後、すぐにペレット4℃で45秒、800×gで卵上清を除去し、4℃で45秒間、800×gでペレットを遠心分離し、滅菌水10mlで二回、ペレットをすすぐ
  9. 漂白した後、100μg/ mlのテトラサイクリンを補充したmCeHR培地10ミリリットルを含む25cm 2の組織培養フラスコに卵ペレットを転送します。無菌技術を使用してこの手順を実行します。所望であれば、無菌の液体培養における細菌の増殖を防ぐために、250μg/ mlのナリジクス酸を含む追加の抗生物質を、追加する。
  10. 約70 rpmで振とう培養器で20℃で液体培養をインキュベートする。
  11. 発展段階や成長率に注目することは日々のワームを確認してください。
    注意：ワームは、最初はゆっくりと成長し、産卵期になるために7〜10日必要となります。ワームは、液体培地に順応しかし、世代時間は、野生型（N2）ワームは約4日間に減少します。
  12. ワームはDEVEを取得した後コニカルチューブにワームの文化を転送し、スイングバケットローターを使用して、4℃で5分間800×gでワームをペレット、液体培地中の妊娠の段階にloped。
  13. 上清を除去し、穏やかに0.1MのNaClを等量のウォームペレットを再懸濁。例えば、mCeHRの10ミリリットルで培養されたワームのために0.1MのNaClの10ミリリットルを使用しています。ワームは、氷上で5分間沈降することができます。
  14. ステップ3.5から3.8に、上記のような漂白手順を実施し、ワームは無菌液体培地中で第二世代のために成長することができます。必要に応じて、細菌増殖を阻害するために、再度、抗生物質を加える。
  15. 再びワームは、ステップ3.12と3.13で説明したように、ステップ3.5から3.8で説明したように同期化された集団を生成するために、再び漂白して、0.1MのNaCl中のワームをペレット化し、再懸濁し、妊娠になることを許可。今から、抗生物質を含まない液体培地中でのL1幼虫ワームを育てる。

液体から4。同期ワーム文化

  1. ペレットとステップ3.12と3.13で、上記のよう0.1MのNaCl中のワームを懸濁します。ステップ3.5から3.8で説明したように漂白剤。
  2. M9緩衝液10ml中に卵のペレットを再懸濁し、幼虫が回転プラットフォームシェーカー上で20℃でO / Nを孵化することができます。注：卵は、L1幼虫に孵化しますが、L1の段階でワームを同期、さらに発展しません。
  3. 維持·サブカルチャーワームは、5分間800×gでペレットのL1幼虫は、10 mCeHR mlの25cm 2のフラスコへの転送中に幼虫を再懸濁する。ワームは、回転プラットフォーム上で20℃で成長させる。ワーム十分な栄養を確保するために、3000ワーム/ミリリットル/ cm 2の最大密度を維持する。
    注：この段階では、抗生物質の手順は、層流フード内で無菌技術を用いて実施される無菌状態を維持するために必要とされない。ワームは、成長を監視するために、毎日チェックする必要があります。

5。無料無菌ミディアム培養にシュッと解凍ワーム

  1. 無菌非同期ワーム培養または液体窒素中で同期されたL1幼虫を凍結する。 5分間800×gでペレットワームはその後、各バイアル用の0.5ミリリットルを使用して、S緩衝液（6.45 mMのKHPO 4、43.55ミリモルKHPO 4、146.25のNaCl）を懸濁します。各バイアルは30％v / vのグリセロールでS緩衝液を等量の液体を追加し、N 2中で長期保存の前に-80℃にワームを転送する。各バイアル内のミリリットル当たり約1×10 6ワームを凍結する。
  2. ほとんど全ての氷が融解するまで約2分間、37℃でバイアルをインキュベートすることにより、ワームを解凍する。層流フードにおいて、mCeHRを含む滅菌フラスコにワームを転送し、20℃でそれらを配置

6。mCeHR成長と生殖に対するヘミン濃度の効果を決定する

  1. Cの栄養素依存性増殖をアッセイする無菌mCeHRメディアを使用虫 。エフェクトOを測定するために、ワームの成長と発展にFヘミン濃度、同期された無菌のN2ワームや関心のある他の菌株を使用しています。 4章で前述したように、L1幼虫を同期します。
  2. 翌日、ペレット、同期のL1幼虫をカウントし、無菌の媒体のμLあたり1ワームに希釈する。 0.3MのNH 4 OH中の10mM塩化ヘミンを作成し、濃HClを用いてpHを8に調整してください。
  3. 24ウェルプレートにmCeHRメディアの800を添加する。メディア100μlの各ウェルに100ワームを追加します。 0μM、1.5μMから三重に1,000μMの範囲の濃度で各ウェルに塩化ヘミンを追加します。全てのウェルは、0.3MのNH 4 OHを同じ濃度が含まれていることを確認してください。穏やか100 L1幼虫を各ウェルに添加されることを保証するためにピペッティングする前に、ワームを再懸濁した。
  4. 日々のワームを調査し、各ウェル中の各濃度の増加に注意してください。 9日間のインキュベーション後のワームの数をカウントし、各ヘムに対応するワーム/ mlの数をプロット濃度（ 図1）。

ヘムセンサーワームに対するヘミン濃度の7。効果

  1. 4μM、8、10μMおよび20μMのヘミンを含むmCeHRにおける同期化のL1ヘムセンサーワーム（PHRG-1 :: GFP）をインキュベートする。
  2. 蛍光共焦点顕微鏡、48時間後のインキュベーション（ 図2）を使用して画像のワーム。

8。トランスジェニックC.を生成するための mCeHRを活用微粒子砲撃を使用して、 虫

注：生成およびmCeHRで栽培UNC-119（ED3）ワームを使って微粒子衝撃を実施するための手順を図3 13に概説されている。

  1. ワームの準備
    1. 砲撃の前に175cm 2のフラスコ1週間でmCeHR培地90ミリリットル中に約1×10 6非同期UNC-119（ED3）ワームを転送します。ワームは20℃、Oで成長することができます〜70回転（ 図3-1）で振盪プラットフォームNA。
      注：一週間後、ワームの密度は、多くの大人の妊娠ワームと大幅に大きくする必要があります。約3×10 7のワームは、微粒子衝撃のために必要となります。
    2. 寒JM109 E.大腸菌は、氷の上10cmのNGMプレートを播種した。
    3. 2 50ミリリットルコニカルチューブに無菌ワームを移し、2分間800×gでワームを遠心する。上清を吸引し、M9バッファー（ 図3-2）の50ミリリットルで、各チューブ内のワームを懸濁します。
    4. 成虫は、氷の上で10から15分間、重力によってペレット化することができます。
      注：2ミリリットルペレットは今> 90％の成虫が含まれている必要があります。この2ミリリットルペレットは約5×10 6のワームを持っており、1微粒子衝撃のために十分である必要があります。
    5. コー​​トチルドJM109の表面全体がワームの2ミリリットルペレットとNGMプレートを播種した。完全に吸収される液体は、その後、プレートを残してできるように（ 図3-3）を進める前に、氷上で30分間。
  2. 金粒子の調製
    1. シリコン処理微量遠心チューブに金粒子30mgを秤量する。 1ミリリットルの70％エタノールを加え、5分間チューブをボルテックスする。
    2. チューブは金粒子をペレット化し10秒間6000×gで遠心分離し、その後、15分間座ってすることができます。慎重に金粒子にチューブの反対側に先端に触れることにより、ピペットチップを用いて上清を除去する。
    3. 1分間の滅菌水1ml、ボルテックスで金粒子を洗浄し、簡単に10秒間6000×gでチューブを遠心する。無菌50％グリセロール0.5mlに金粒子を再懸濁して、二回の洗浄ステップを繰り返します。
      注：金粒子の最終濃度は60 mg / mlであろう、それは、4℃で1〜2ヶ月間保存することができる
  3. DNA-金粒子ミックスを調製する
    1. 10で所望のプラスミドDNAの10μgのを組み合わせ＆＃956;シリコン処理した1.5mlマイクロチューブ内のUNC-119レスキュープラスミドのG。その後、1分間渦を脱イオン水50μl、よく再懸濁した金粒子溶液100μlを加える。
    2. 2.5Mの塩化カルシウムを150μlを加え、1分間再びソリューションをボルテックスする。この溶液に、3から5分間、0.1Mスペルミジンと渦の60を添加する。
    3. パルスは10秒6000×gで解決策を遠心、上清を除去し、70％エタノールを300μlを加える。 1分間よくボルテックス、6000×gでのパルス遠心、100％エタノール170μlの上清と再懸濁を削除します。積極的に5から10分後、遠心分離器をパルスし、上清を除去するためのソリューションをボルテックスする。
  4. 衝撃（ 図3-3）
    注：このプロトコルは材料/機器の表で指定された粒子デリバリーシステムを用いて行われる。利用可能な粒子送達器具のための指示に従ってください。
      <李> 15cmのプレートにティッシュペーパーのシートを配置します。ピンセットを使用して、100％エタノール中に個々に7 macrocarriersを浸し、乾燥さ組織上に横たわっていた。
    1. 徹底的に70％エタノールでバイオリスティック室、マクロキャリアーホルダー、ターゲットプレートを清掃してください。清潔で、各衝撃手順の前に停止画面をオートクレーブ。
    2. 座席のツールを使用してホルダーにピンセットやプレスを用いてホルダーにmacrocarrriersをロードします。
    3. 均等に各マクロキャリアーの中心にあるのDNAコーティングされた金粒子の20μLを広め、次いで、溶液を完全に乾燥させます。
    4. エタノールで圧力分配器の2つの部分をきれいにし、エタノール洗浄破裂板と集合。衝撃室に組み立てられた圧力分周器と破裂板をネジ止めします。
    5. マクロキャリアホルダーをオートクレーブ停止画面を組み立て、必要な金属の棚上に装置を配置し、所定の位置にロックします。
    6. 組み立てMACRを挿入ocarrier圧力分配器下の割り当てられたスロット内の遺伝子銃室への装置と圧力分割器を使って合わせます。
    7. ターゲットプレート棚の上にワームとのオープンNGMプレートをテープと室のドアを閉じます。
    8. ワームに衝突、破裂板を破壊するのに必要な圧力を調整します。ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押して、水銀の圧力の28インチの真空をオンにします。
    9. 真空を解除し、装置からNGMプレートを取り外します。プレートからワームを洗って20 10cmのNGMプレートに再配布JM109 E.を接種大腸菌 （ 図3-4）。
    10. ワームは25℃で10〜14日間成長し、プレートを飢えすることができます。 のunc-119欠陥から救出ワームは、通常の動きを有するであろうし、この時点で同定することができる。これらは独立したトランスジェニック系統（Figurを表すように、さらなる分析のために別々のプレートから少なくとも10「野生型」ワームを選ぶE 3-5）。

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結果

C.を培養Eで発生した二次代謝産物からの干渉なしに、ワームが必要とする栄養素の決定における無菌液体培地エイズ虫大腸菌 。野生型N2ワームは、3世代以内にmCeHRメディアに順応し、NGM細菌プレート上で培養したワームに匹敵する成長を示す。実際、これらのワームは、OP50細菌上に成長したワームのための3.5日に比べて、4日以内に妊娠になる。

mCeH...

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ディスカッション

このプロトコルでは、急激な温度が可能に変更された無菌の液体メディアmCeHRを提示ワームは、多数の生産を生成エレガンス 。ワームは、Eを汚染することなく成長しているように、このメディアは、いくつかの利点を示しています大腸菌や細菌の副生成物及び栄養と毒性試験に利用することができます。 Eの使用このような研究において、大腸菌また?...

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開示事項

著者らは、競合する経済的利益や利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この作品は、HealthGrants DK85035及びDK074797（IH）の国立研究所によってサポートされていました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MgCl2•6H2OSigmaM-2393
Sodium citrateSigmaS-4641
Potassium citrate monohydrateSigmaP-1722
CuCl2•2H2OFisherC455-500
MnCl2•4H2OFisherM87-100
ZnCl2SigmaZ-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2OSigmaF-1018
CaCl2•2H2OFisherC70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium saltSigmaA-1752
Cytidine 5 -phosphateSigmaC-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphateSigmaG-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium saltSigmaU-6375
ThymineSigmaT0376
N-AcetylglucosamineSigmaA3286
DL-AlanineFisherS25648 
p-Aminobenzoic AcidSigmaA-9878
BiotinSigmaB-4639
Cyanocobalamine (B-12)SigmaV-2876
Folinate (Ca)SigmaF-7878
NiacinSigmaN-0761
NiacinamideSigmaN-3376
PantetheineSigmaP-2125
Pantothenate (Ca)SigmaP-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)ACRCS21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphateSigmaP-3657
Pyridoxamine 2HClSigmaP-9158
Pyridoxine HClSigmaP-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)SigmaR-7774
Thiamine HClSigmaT-1270
DL-6,8-Thioctic AcidSigmaT-1395
KH2PO4SigmaP-5379
Choline di-acid citrateSigmaC-2004
myo-InositolSigmaI-5125
D-GlucoseSigmaG-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysateSigmaL-9010
Brain Heart InfusionBD211065
Hemin chlorideFrontier ScientificH651-9
HEPES, sodium saltSigmaH-3784
CholesterolJ.T. BakerF676-05
MEM Non-Essential Amino AcidsInvitrogen11140-076
MEM Amino Acids SolutionInvitrogen11130-051
Nalidixic acid sodium saltSigmaN4382
Tetracycline HydrochlorideMP Biomedicals2194542
Biolistic Delivery SystemBioRad165-2257
Gold particles (Au Powder)  Ferro Electronic Material Systems6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μmBioRad 165-2263

参考文献

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