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要約

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

要約

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

概要

リンパ節は、外国と自己抗原に対する適応免疫応答が開始され、調整されている特殊なコンパートメントである。ここに提示手順は、リンパ節単一細胞懸濁液を得て、いくつかの分子の表面発現を維持する実行可能な節間質細胞へのアクセスを得るために自動化された機械的ピペッティングと組み合わせる短い酵素消化を記載している。

リンパ節間質細胞、リンパ節の足場を形成し、三つの主要な機能を果たす：最初それらは存在する抗原、病原体およびそれらの病原体関連分子パターン（PAMPに）、ならびにサイトカインおよび危険性関連分子パターン（DAMPS）をサンプリングするために体液をフィルタリング体内で。第二に、それらが相互作用し、適応免疫応答を開始するための抗原提示細胞（APC）およびリンパ球を誘引し、指示する。第三に、それらは、リンパ球1の恒常性および分化のための構造的な環境を提供する-3。炎症リンパ節間質細胞は、成長因子、サイトカイン及びケモカインを産生中に、樹状細胞（DC）との相互作用を整理することにより、T-およびB細胞膨潤に適応する。免疫応答のオーケストレーションは、異なる間質細胞集団によって形成される複合体の構造的アーキテクチャにのみ可能である。

リンパ節間質細胞は、CD45陰性細胞で、線維芽細胞および内皮細胞においてCD31の発現またはGP38によって1-6を区別することができる。 GP38 + CD31が- （もFRCとしても知られ、TRC、：線維芽細胞細網細胞）、Tゾーンの網状細胞を定義して、GP38 + CD31 +がリンパ管内皮細胞（LEC）を定義して、GP38 - CD31 +は、血液内皮細胞（BEC）を定義します。さらに、集団の特徴付けは、他のリンパ節間質細胞の存在が明らかになった。実際、小周皮細胞様細胞集団内で特徴づけられたGP38 - CD31 -人口7。したがって、単離手順の適応は、異なるリンパ節間質細胞の機能的特性の同定および特徴付けのために有利である。

リンパ節間質細胞消化の開発の前にリンパ節間質細胞の研究は、組織切片や顕微鏡を用いてその場観察にに限られていたプロトコル。それにもかかわらず、構造的および機能的研究は、リンパ節間質細胞の重要な特徴を示した。リンパ節間質細胞は、高内皮へのリンパ節の被膜下洞からリンパおよび関連する低分子量タンパク質を輸送する導管システムと呼ばれる複雑な3次元構造を形成するポドプラニン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス（ECM）タンパク質と関連しているT細胞ゾーン8に静脈。 DCは、間質細胞と密接に接触している管状詐欺に突出観察することができるduit構造は、流体サンプルと抗原8を検出する。 DCとリンパ節間質細胞（TRCはとのLEC）の相互作用はケモカインCCL21とCCL19 9,10の放出および提示によって媒介される。 CCL19およびCCL21は、リンパ節のT細胞領域4,11に移行するDCおよびT細胞を促進するCCR7受容体によって認識される。類似したケモカインを使用しているにもかかわらず、DCとT細胞は、リンパ節12内に異なった移動ルートを持っている。その後、リンパ節および純粋なリンパ節間質細胞の単離の酵素消化を使用して、機能的研究は、異なるリンパ節間質細胞の役割とDCおよびT / B細胞6,13と相互作用するその能力に基づいて行った。まず、IFN-γ産生エフェクターT細胞及びリンパ節間質細胞間のクロストークは、二次リンパ器官14-16にT細胞応答および増殖を弱めることが示さ代謝産物一酸化窒素の産生を誘導する。第二に、リンパnはオード間質細胞は、IL-10の産17を介して規制DCサブセットの分化を支持すること、およびIL-7 6,18の産生を介してナイーブT細胞の恒常性を調節することが報告されている。第三に、リンパ節間質細胞におけるTLRの発現は、間質細胞は、組織傷害において放出、感染または自己分子に由来する信号の影響を受けやすいことを示唆している。実際に、TLR3ポリリガンドとリンパ節間質細胞の処理は、（I：C）は、結果として共阻害分子PD-L1のではなく、共刺激分子の主要組織適合性複合体クラスIの発現及び上方制御の控えめな上方制御を誘導する末梢組織抗原発現の19の劇的な変化。いくつかのグループが、リンパ節間質細胞は、末梢組織抗原を発現し、自己反応性T細胞19,21-27の寛容を誘導することが示されている。したがって、リンパ節間質細胞および他の遊走および再間の相互作用を理解することsidentリンパ節細胞は、炎症の間に活性化または免疫応答の抑制を可能にする新たな標的分子を見つけるために役立つ。したがって、リンパ節の公開酵素分離の実施が必要である。

以前公開されたプロトコルは、低機械的ストレス6,19,20とコラゲナーゼベースの酵素消化の異なる組み合わせを使用しています。しかし、消化酵素または消化酵素の異なる組み合わせの長いインキュベーションは、活性化状態を分析するために、新たなリンパ節間質細胞を同定するために必要な各種表面分子を劣化させるかもしれない。間質細胞分析の種類に応じて、リンクプロトコルまたはフレッチャー·プロトコルは、より適しているかもしれません。記載された手順では、わずかに短い酵素消化は、実行可能なリンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限にするために自動化された機械的解離と組み合わされる。この手順では、再現性の高い分離を可能にし、低い変動性と95％以上の生存率を有するリンパ節間質細胞集団の区別。新たに単離したリンパ節間質細胞は、 インビトロで直接機能アッセイを実行するために、表面マーカー発現、タンパク質分析、および転写の研究、ならびに間質細胞株の樹立のために使用することができる。

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プロトコル

このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物手順は州立機関バーゼル=シュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。

1。リンパ節の準備と消化

  1. 加熱プレートとマグネチックスターラー上で37℃にビーカー内の前の熱水。
  2. 次のような基本的なミディアムを準備したDMEM培地（ピルビン酸なし）、2％FCSを補充し、1.2mMのCaCl 2およびペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μgの）。
  3. 使用前にすべての解剖器具を滅菌する。
  4. CO 2窒息あたりのリンパ節ドナーマウスを安楽死し、無菌的にリンパ節を解剖。周囲の脂肪を解剖しないでください。注：このプロトコルは、末梢皮膚流入領域リンパ節（鼠径、上腕、腋窩）に最適化されています。
  5. 2ミリリットルの氷冷塩基性媒体を含む滅菌ペトリ皿にリンパ節を配置します。
  6. リンパ節CAを混乱させる1mlシリンジに固定された2つの25のGの針を使用してpsule。
  7. 1 mg / mlのコラゲナーゼIVおよび40μg/ mlのDNアーゼIを補充した750μlの基本培地を含む5ミリリットルのポリプロピレン丸底チューブ内の破壊されたリンパ節組織を転送
  8. 各チューブ内の1つの無菌磁気攪拌機を追加します。
  9. 37℃でビーカー内の場所チューブは、水を予熱し、30分間ゆっくりとした速度（1ラウンド/秒）で、チューブをかき混ぜる。
  10. 加熱板と磁気攪拌機からチューブを外し、リンパ節の断片が安定しましょう​​。
  11. 慎重に「非間質細胞」が濃縮された上清を除去。注：T、B、樹状細胞およびCD45を分析する場合- GP38 - CD31 -は予見され、「非間質細胞」部分を保存します。
  12. 洗浄は750μlの基本培地で1回リンパ節組織を残り。注：この手順は、免疫能力のあるマウスを操作する場合にのみ必要です。
  13. リンパ節断片が沈降しましょう​​。
  14. 削除する非間質細胞浮遊割合。
  15. リンパ節フラグメントに750μlの基本3.5ミリグラムを添加した培地/ mlのコラゲナーゼDを追加し、40 / mlのDNアーゼI。
  16. バックを37℃予熱した水を入れたビーカー内チューブを配置します。
  17. ゆっくり攪拌しながら5分間リンパ節組織を消化。
  18. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で10サイクル700μlの混合。注：これは消化を改善するためにリンパ節組織を破壊する。
  19. 37℃の予熱された水で戻ってビーカー内チューブを配置します。
  20. ゆっくりと撹拌しながらさらに10分間、リンパ節組織断片を消化。
  21. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で99回混合する。
  22. 単一細胞懸濁液の維持を確実にするために、0.5MのEDTA 7.5を添加する。
  23. パイプによってリンパ節組織断片を分解準自動化されたマルチチャンネルピペットを用いて、最大のスピードで99サイクルで混合。
  24. 750μlの塩基性媒体を追加し、70μmのナイロンメッシュを通して細胞を渡します。
  25. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を5分間。
  26. 間質細胞は現在、さらなる分析のために使用することができる。

リンパ節間質細胞の染色2。

  1. 成功したTRC、LEC、BECおよびDN細胞を認識するために抗CD45、抗ポドプラニン（GP38）、抗CD31抗体の組み合わせを使用してください。
  2. 2を含む100μlのHBSS中の抗GP38-PE（1：200）、抗CD31-APC（200 1）：ライブ/デッドトラッカー、抗CD45-FITC（200 1）で消化したリンパ節組織をインキュベート暗所で少なくとも20分間％のFCS、4°C、。
  3. 2％FCSを含むHBSSの500リットルを追加し、細胞を洗浄
  4. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を3分。
  5. 2％FCSを含むHBSS100μl中に再懸濁する。
  6. equippフローサイトメーターで染色された細胞を実行します以下の光学系とED：励起最大3つのレーザーを持つソース：青（488nmで、空冷式、20 mWのソリッドステート）、赤（633nmで、17 mWのヘリウムネオン）、バイオレット（405nmで、30 mWのソリッドステート） 。
  7. 門CD45 -細胞は造血細胞を排除する。
  8. ダブレットと死細胞を除外するためのゲート·シングレット（FSC-W）と生細胞（LIVE / DEADトラッカー）。
  9. 、LEC（GP38 + CD31 +）、BEC（GP38 - CD31 +）およびDN（GP38 - CD31 - ）細胞（ 図1参照） - TRC（GP38 + CD31）を可視化する、CD31 対プロットGP38。

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結果

現在のプロトコルが原因自動化されたマルチチャンネルピ ​​ペットで機械的に解離に短い消化時間（45分以内）にリンクら 、2007 6によって公開修正された消化プロトコルです。また、手順はより標準化され、異なるリンパ節間質細胞上の表面マーカーの劣化を最小限に抑え、同時に複数のサンプルの処理を可能にする。

コラゲナーゼIVおよびコラゲナー...

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ディスカッション

リンパ節間質細胞の研究は、最近公開された消化による2プロトコル6,13の開発に研究の焦点となった。両方のプロトコルは、単一のリンパ節間質細胞を獲得するのに十分であるが、消化酵素と消化の時間の使い方が異なります。間質細胞およびそれらの表面マーカーは、酵素消化および機械的応力に敏感であるため、最適化されたプロトコルが必要とされる。

新?...

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開示事項

The authors declare they have no competing financial interests.

謝辞

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSFinal concentration 2%
CaCl2Sigma499609Final concentration 1.2 mM
Collagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase DRoche11088882001use at 3.5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001use at 40 µg/ml
Stiring magnetsFAUST5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating functionIKA-RCT-standard9720250
Petri dishes 100 mm, sterileTPP6223201
25 G needlesTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
anti mouse Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti mouse CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µl max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kitInvitrogenL10119

参考文献

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