タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

要約

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

要約

1940透過型電子顕微鏡（TEM）ので、生物学的材料の超高分解能画像で生物を提供している。しかし、理由もアーチファクトのない試料の調製の経験を求めて、面倒で時間がかかるのプロトコルにより、TEMはユーザーフレンドリーな技術とはみなされません。 TEMのための伝統的なサンプル調製は、細胞構造を維持するために化学固定剤を使用した。高圧凍結することにより細胞の超微細構造の完全性に有害な氷の形成を制限し、非常に速い冷却速度を生成するために、高圧下での生体サンプルの低温固定である。高圧凍結し、凍結置換は、現在TEM用樹脂切片における最高品質のモフォロジーを製造するための最適な方法である。これらのメソッドは、通常、薄い切片のTEMのための従来の処理に関連する成果物を最小限に抑えます。低温固定した後、サンプル中の凍結された水が液体で置き換えられる低温での有機溶媒は、プロセスは、凍結置換と呼ばれる。凍結置換は、典型的には、専用の高価な設備で数日間にわたって行われる。最近の技術革新ではなく通常の2日間で、プロセスは3時間で完了することを可能にする。これは、典型的には、浸潤およびセクショニングの前にエポキシ樹脂中に包埋を含む試料調製のいくつかのより多くの日が続く。ここでは、植物試料の固定は時間内で達成されることを可能にする、高圧凍結急速凍結置換を組み合わせたプロトコルを提示する。プロトコルは、容易に他の組織または生物を操作するために適合させることができる。植物組織が原因曝気スペースと水の氷のない凍結を妨げる水で満たされた空胞の存在のために、特別な関心事である。また、化学的固定化のプロセスは、組織内の深いへの化学物質の浸透を妨げ、細胞壁のために、植物では特に長いです。植物組織は、したがって粒子フィルタであるularly挑戦が、このプロトコルは、信頼性があり、最高品質のサンプルを生成する。

概要

細胞の超微細構造の私たちの知識は、数ナノメートル¹の範囲の内容を解決することができ、電子顕微鏡から主に来る。サンプル調製は時間がかかり、面倒なプロトコルを必要とし、開業医からいくつかの専門知識を要求するように分解能TEMで非常に強力であるにもかかわらず、ユーザーフレンドリーとはみなされません。サンプルの伝統的な固定は、樹脂中に埋め込み、次いで重金属で染色した超薄切片を作製するために切片化、脱水を含むさらなる処理の前に、アルデヒドおよび四酸化オスミウムの使用を組み合わせている。しかしながら、化学的な固定は、最終的にいくつかの細胞区画²に影響^を与える膜へのタンパク質凝集及び脂質¹の損失、および変更を含むアーティファクトを生成することが知られている。これらのアーティファクトは、主に、室温^3、4、5で固定し、脱水の遅い速度に起因する。

高圧凍結（HPF）による低温固定は、化学固定によって引き起こされるアーティファクトのほとんどを回避できます。低温固定の原理は^、7。HPFが低下し^、20度の水の凝固点を低下させる氷結晶の核生成及び成長を遅くし、細胞成分を本質的に⁶固定されているように、生物学的サンプル中の水の粘度を増大させることであるミリ秒単位の非常に高圧（210 MPa以上2,100バール）の下で、液体窒素とサンプルの温度、。適切に行われると、HPFは、細胞の超微細構造に大きな損傷を引き起こす可能性があり、大きな氷結晶の形成を防止する。 HPFは、生物学的溶質⁷の典型的な濃度で100〜200ミクロンの厚さのサンプルを固定するために使用することができる。多数の物理学の口コミHPF、 たとえば ^1、7,8の基礎となる原則があります。

HPF後、試料を低温でインキュベートする（-78.5°C〜-90＆＃176; C）は、一般的に数日間、四酸化オスミウムなどの化学固定剤を含有する液体有機溶媒の存在下で行われる。この低い温度では、サンプル中の水、有機溶媒、典型的にはアセトンまたはメタノール^1,9によって置換される。したがって、このプロセスは、凍結置換（FS）と呼ばれている。次いで、試料を次第に温め、この時間の間、通常は四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニル⁹と、固定されている。低温での架橋は^1を固定化された分子を固定するという利点を有する。 FSしたがって、改良された超微細構造の保存をもたらし、特に、室温で通常の化学的固定により固定したものに比べて優れた品質、抗原性の良好な保存のサンプルを生成し、未結合の細胞成分^10,11の損失を減少させた。

最もFSは、典型的には数日間まで、長期間にわたって行われる。これは、特にトゥルーである植物標本^12、13、14の電子。マクドナルドやウェッブによって開発された最近のプロトコルは大幅に数時間から¹⁵数日からFSのための時間を削減します。スーパークイックFS（SQFS）でサンプルが90分で処理されている間、それらの急速凍結置換（QFS）手順では、FSは、3時間かけて行われる。これらの方法により作製したサンプルの品質は、従来のFSプロトコルによって得られたものに匹敵する。私たちは、HPF後に植物試料の下流処理のためQFSプロトコルを採用しています。 QFSおよびSQFSではなく、高価な市販のFSマシンの一般的なラボ機器を使用するため、これは、時間だけでなく、お金ではないだけを保存することが証明されています。

植物組織は、多くの場合、TEMの準備をすることは非常に挑戦的である。平均して、植物細胞、細菌細胞または動物細胞のいずれよりも大きくしている。疎水性のワックス状のキューティクル、厚い細胞壁、有機酸、加水分解酵素とフェノールcを含む大きな水で満たされた空胞の存在総細胞体積¹⁶の最大90％を占め、曝気スペースの存在は、深刻なシステム¹⁷の熱伝導率を低下させることができるompounds。さらに、植物の場合には、試料の厚さは、ほとんどの場合は20μm、化学的固着の使用の制限を超えています。これらの厚さで、水の低い熱伝導率は、サンプルの中心に凍結速度を超える-10,000°C /秒のを防止する。その速度は、有害な六角形の氷の形成（10〜15ナノメートルよりも低い密度と大きな氷結晶^）8を回避するために必要とされる。サンプルの適切な凍結およびその後のFSの両方に同時に、これらの課題を提示。それにもかかわらず、低温固定は植物試料を固定するための最良の方法です。ここで植物組織試料のHPF-QFSのためのプロトコルが提示される。これは、モデル種のシロイヌナズナに焦点を当て、またベンサミアナタバコで使用されてきた。典型的な結果は、HPF-QFSはSAを生成することを実証わずかな時間での伝統的なHPF-FSに匹敵する品質のmples。適切な調整で、このプロトコルは、他の比較的厚い生物学的試料のために使用することができる。

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プロトコル

注：QFS手順は、ユーザが十分な注意と注意を必要とし、私たちは、適用上の注意と注意事項としてここにこれらの安全上の注意を強調表示します。

HPFラン用1.Preparation

1. サンプル調製を開始する前に、製造業者の指示に従って、高圧冷凍庫の電源をオンにします。
   注：このプロトコルで使用されるHPFユニットがWohlwendコンパクト02単位（ 図1A）で、HPFの実行前には開始することができる起動手順の1時間半に約1かかります。
   1. Wohlwendコンパクト02高圧冷凍庫に切り替える。
      1. "1"から"0"メインスイッチを回すことにより、機器のスイッチを入れる。
      2. マシンに圧縮空気を解放します。
      3. マシンに液体窒素をリリースします。
      4. "SYSTEMドライUP」ボタンを押します。
      5. 30分後、「本稿では、Webを押してくださいMドライUP」ボタンを押します。
      6. 計器のスイッチを入れる「ON / OFF」ボタンを押します。
      7. 「窒素」ボタンを押します。
      8. 「DRIVE IN」ボタンはすでに点灯している場合でも、マシンは20分間冷却して。
      9. ボタン "でドライブ"が点灯。
      10. ボタン "でドライブ」を押します。
      11. 「AUTO」ボタンを押します。
      12. 「SYSTEM READY」ボタンが点灯します。
      13. 圧力室に温度と圧力プローブを配置し、ピンを使用して固定します。
      14. 「JET AUTO」ボタンを押します。このステップは、必要に応じて圧力上昇と温度低下であることをチェックする。基本的に試運転。シャープは、温度に低下し、圧力の急激な増加は、（ 図1B）が期待されている。
      15. さらに2つのジェットのサイクルを実施する。

Receiviのため2。準備ngの冷凍サンプル

1. 保有者が完全に覆われるように（ 図1C）、（安全上の警告を参照のこと）、液体窒素で冷凍バイアルホルダーを含む断熱箱を埋める。
   注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。
2. 液体窒素（ 図1C）でアルミニウム管ホルダーにFS培地を含むバイアルの適切な数を配置します。最大4つのディスクは、このプロトコルでは、単一のサンプルを含む各単一の凍結バイアルに配置することができます。
   注：バイアルはダイヤモンドひっくり返されたスクライブし、非常に柔らかい鉛筆のような鋭利な器具で標識する必要があります。
   1. QFS中の固定剤のためには、1％のOsO ₄及びアセトン⁹中の0.1％酢酸ウラニルを使用しています。大量に溶液を調製し、液体窒素中で凍結クリオバイアルとストアに1.5ミリリットルのアリコートを分注する。
      注：のOsO ₄及び酢酸ウラニルを処理するための安全に関する警告に従ってください。
      注：のOsO ₄ と酢酸ウラニル危険な化学物質であり、クローズドつま先の靴、白衣や手袋などの適切な保護具（P​​PE）を装着したままドラフト内で処理する必要があります。
      注：QFSのためのサンプルを保持するために使用されるクライオバイアルチューブはのOsO ₄の漏れを避けるために、QFSの間に密封されたままであることを確実にするためにハードにOリングを持っている必要があります。
3. ペーストが滑らかになるまで、爪楊枝又は他のそのような器具を用いて10％メタノールの約等量のパン酵母を混合することにより、酵母ペーストを準備します。酵母ペーストは、細胞外凍結保護剤として作用し、試料キャリア内の試料の周りの空間を充填するために使用される。ペーストの量はサンプル数に依存する。 10サンプルまたはより少ない用ペースト（1ml）をマイクロ遠心管中で混合することができる。

サンプルの3。高圧凍結

1. 植物から興味のある葉（または他の組織）を外し、静かにdentaの作品の上に置きますlのワックス又は他の切断面。葉からサンプルを切断するために2.0mm以下所望の大きさのパンチを使用してください。ピンセットで軽くサンプルを処理し、可能な限り迅速に動作します。
2. 解剖顕微鏡下での作業、型試料キャリア0.2ミリ側にリーフディスクを配置し、酵母ペーストで完全に覆う。ディスクが完全に満たされていることを確認し、ペーストが細かい絵筆（ 図2）を用いてペーストを滑らかにすることにより、ホルダの縁と同じ高さ。
3. 試料ホルダーにキャリアを配置します。タイプB検体キャリア、平らな面を下にしたサンプルをカバー。
   注：試料ホルダーは、乾燥し、室温であるべきである。
4. 試料ホルダーにサンプルを取り、機械に挿入し、1〜2秒で完了するはずです "JET AUTO」ボタンを押すと、冷凍サイクルを開始。
5. 可能な限り迅速に作業を、機械からホルダーを取り外し、SAMPを保持するチップを置くルHPFマシンの上に絶縁されたボックス内の液体窒素に変換する。それらを冷却する液体窒素中で鉗子の二対の先端を浸し。
   注：凍結後、キャリアは、液体窒素冷却した鉗子で処理する必要があります。ウォーム（室温）鉗子は、多くの場合、cryotechniquesの失敗の原因となっています。
6. FS培地を含むクリオバイアルを開き、箱の側面に蓋を置く。液体窒素で冷却したピンセットを用いて、そっとディスクは、液体窒素または蒸気中に常にあることを確認、試料ホルダからディスクを取り出します。液体窒素蒸気での作業、1予冷した鉗子でFSチューブを保持し、FSのバイアル中にホルダーを配置するために、他を使用しています。背面のFSバイアル​​の蓋をねじ込みます。いないトラップのバイアル内の任意の液体窒素の操作を行います。
   注：、QFS用のクライオバイアルに液体窒素がバイアル中に閉じ込められていないことを確実にするためのサンプルを転送する。液体窒素は温暖化とあらゆるTrappeの間に700倍に拡大しdは、液体窒素はこの時間の間に爆発を引き起こす可能性があります。
7. すべての希望するサンプルが凍結されるまで繰り返して3.7に3.1を繰り返します。サンプルの同じタイプを含む複数のリーフディスクを同じバイアルに入れることができる。試料ホルダーを乾燥させ、凍結実行の間に室温に戻しする必要があることに注意してください。すぐにこれを行うには、ブロードライヤーでそれを加熱し、タッチでその温度を監視します。

フリーズ交代のため4。準備

1. 完全に10分間、または核沸騰が止まるまで液体窒素中でアルミニウムヒーターブロックを浸す。これが起こっているが、FSチャンバー（ 図3）として使用される容器の底にドライアイス（1-2センチ）の層を配置します。発泡スチロール容器またはアイスバケットを砕いたドライアイス又はペレットと一緒に、FSのために使用することができる。
2. すぐにヒータブロックの中段に温度プローブと一緒にサンプルを含むクリオバイアルを挿入します。必ずその上に蓋FSメディアがFS中に漏れないようにバイアルをしっかりとねじ止めされている。温度の記録を開始します。
   1. それはチューブの底に達するようにクリオバイアルの上部を通って熱電対を配置することによって、温度プローブを作る。液体が漏れるないように樹脂でチューブのふたを密封。各QFSの実行の開始時に1.5ミリリットルのアセトンでチューブを埋める。
3. 絶縁cryoglovesや大きな鉗子を使用して、ヒーターブロックからすべての液体窒素を注ぐ。クリオバイアルを注ぎないように注意してください。
   注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。
4. QFS室においてドライアイスの層へのバイアルを含むブロックを配置します。チューブが水平に横になったが、わずかな上向きに傾斜しているように、ブロックが置かれていることを確認します。正しいクリオバイアルを使用する場合に漏れがあってはなりません。
5. FS管が覆われるようにそれがする必要はありませんが、ドライアイスでQFS室をパックブロックの上部をカバーしています。チャンバーに蓋を置きます。

5。クイックFS

注：のOsO ₄の漏れが誤って他の予防措置にもかかわらず、発生した場合にはドラフト内でQFSの実行を行います。

1. ドラフト内でプラットフォームロータリーシェーカー上QFS室を置き、120分間125 rpmで回転する。この間、ブロックの温度は、約-80℃に次第に増加するはずである。攪拌は、より良い、FSのための成分の混合を確実にします。
   注：ドラフト中シェーカーの配置とヒュームフードドアの位置がQFS手順全体を通して、サンプルの一貫した温暖化を確実にするために実行するたびQFSのために同じである必要があります。
2. チャンバからドライアイスを取り出し、さらに1時間振盪し続ける。
   注：温度が約-15℃〜-20℃に増加するはずである。
3. QFS室からのサンプルおよび温度プローブを外し、上に置くさらに10〜15分間、室温でシェーカーまで、それらが室温に達する。温度の記録を停止します。
4. FSの間に、HPFマシンをオフにしてください。
   1. HPFマシンは窒素を充填されている間に、液体窒素タンクのタップを閉じます。
   2. 「窒素」ボタンを押します。
   3. 赤い "PISTON DOWN」ライトが消灯するまで待ちます。
   4. 「ON / OFF」ボタンを押します。
   5. "SYSTEMドライUP」ボタンを押します。
   6. マシンへの圧縮空気の供給を遮断する。
   7. 12時間の最小値の後、（存在する水分の乾燥を確実にするため） "0"から "1"にメインスイッチを回すことにより、マシンのスイッチを切る。

6ポストFS処理

1. 慎重に有毒廃棄物の適切な容器にプラスチック製ホールピペットと場所で、FSメディアを取り出します。
   注：のOsO ₄及び酢酸ウラニルは危険な化学物質であるクローズドつま先の靴、白衣や手袋などの適切な保護具（P​​PE）を装着したままとドラフト内で処理する必要があります。
2. 洗浄サンプル、100％アセトンで4回。最初の2回の洗浄を収集し、有毒廃棄物容器内に配置します。
3. 細かい鉗子を使用して、所有者からの組織サンプルを削除します。これが行われているようにアセトンで湿ったサンプルを保管し、破損のサンプルを回避するために、非常に静かに動作します。
   注：これは珍しいことではないし、それが実際に酵母ペーストは、この時点でサンプルから離れて落ちる有することが有用であり得る。葉組織がまだ緑である間酵母ペーストは通常​​、非常に濃い茶色です。
4. アセトンを含むクリオバイアル内のサンプルを収集します。通常のプロトコールに従ってTEM用サンプル調製（浸潤と埋め込み）を続行します。

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結果

以下に示す結果は、HPFのためWohlwendコンパクト02（ 図1A）を使用して得られている。この装置の1つの主な利点は、試料キャリア及びその所有者の使いやすさである。他の楽器を使用する場合は、マクドナルド、2人のユーザーが、他の凍結を行い、FSへの転送が^9をクリオバイアルながら試料を調製する試料調製とHPF、1を行うべきであると推奨しています。しかし、Wohlwend標...

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ディスカッション

ここで紹介するプロトコルの成功は、ユーザーに大きく依存します。まず、先進的な製造は、すべての必要な材料が容易に入手でき、全体のHPF-QFSの実行を完了するのに十分な量であることを保証するために必要とされている。第二に、これにより、ユーザは、組織の天然状態への変更を最小限に抑え、試料の取り扱いを最小限にする効率的な方法でのステップ·ツーステップから移動し、す?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs