の世代<em&gt;エンテロバクター</em&gt;エスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

要約

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。

要約

栄養細菌は、炭素及びエネルギー源として使用される培地グルコース（M-9培地）を補充したM-9最小塩、上で成長する。栄養要求株は、トランスポを用いて生成することができる。このプロトコルで使用される市販のTn 5由来のトランスポはR6Kγ複製起点を含むDNAの線形セグメント、カナマイシン耐性遺伝子から成る二つのモザイク配列は、トランスポザーゼ結合部位として機能する、終了する。 DNA /トランスポザーゼタンパク質複合体として提供されるトランスポは、原栄養株、 エンテロバクター属にエレクトロポレーションによって導入される。 YSUし、無作為に、このホストのゲノムに自身を内蔵しています。形質転換体をカナマイシン（LB-館）を含む寒天プレートルリア - ベルターニ上にプレートレプリカとカナマイシン（M-9館）を含むM-9培地寒天プレート上にある。 M-9館プレート上LB-館プレート上で増殖ではなく、形質転換体は、栄養要求株であると考えられている。精製したゲノム栄養要求株からのDNAを部分的に消化されたライゲーションおよびpir ⁺大腸菌（E. coli）株に形質転換する。 R6Kγ複製起点は、プラスミドがPIR ⁺ E.内で複製することができますcoli株 、およびカナマイシン耐性マーカープラスミドの選択を可能にする。各形質転換体は、中断された染色体領域により隣接トランスポゾンを含む新たなプラスミドを保有する。サンガー配列決定および基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）が中断された遺伝子の推定アイデンティティを示唆している。このトランスポ突然変異誘発戦略を使用して、3つの利点がある。まず、ホストによってトランスポザーゼ遺伝子の発現に依存しない。第二に、トランスポはエレクトロポレーションによってではなく、コンジュゲーションによって、または形質導入によって、標的宿主に導入されるため、より効率的である。第三に、R6Kγ複製起点は、それが簡単に突然変異したグラムを同定することを可能にする部分的組み換えプラスミドにおいて回収されるエン。この技術は、 エンテロバクター属の他の特性に関与する遺伝子を調べるために使用することができる。 YSUまたは細菌株の幅広い種類の。

概要

栄養細菌は、培地中の生合成^1は 、アミノ酸、核酸、ビタミンのような前駆体を生成するために、中心炭素代謝の経路を介してグルコースに変換し、グルコース（M-9培地）を含有するM-9最小塩で成長する。 M-9培地は、炭素源およびエネルギー源としての硫黄源、およびグルコースなどの緩衝液およびリン源としての窒素源、ナトリウム、カリウム、リン酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸を含んでいる。ルリア - ベルターニ（LB）培地トリプトンからビタミン及び酵母抽出物からの成長因子のアミノ酸が豊富である。これは、M-9培地上で生育に必要なアミノ酸、ビタミンおよび他の成長因子を合成することができない栄養要求株の増殖を支持する。栄養要求株は、M-9培地中でLB培地ではなく、成長するのに対し、このようにして、原栄養は、LBとM-9培地中で成長します。細菌の栄養集団に変異を導入し、栄養要求性表現型を引き起こす変異した遺伝子を同定することにより、経口であるバクテリア株中での代謝の理解を得るためにssible。

トランスポゾン突然変異誘発は、M-9培地中のグルコース上での増殖に必要な遺伝子の多くを同定するために用いることができる。トランスポゾンは宿主ゲノム²に無作為に自分自身を挿入します。 M-9培地寒天プレート上にLB寒天プレートおよびそのめっきレプリカ上のトランスポゾン形質転換体をスポットすることにより、栄養要求株をスクリーニングすることが可能である。中断の遺伝子は、遺伝子の救助を介して同定されている。この研究は、市販のTn 5はトランスポゼース蛋白質と混合線形トランスポゾンDNAセグメントのソリューションとして出荷されているトランスポを由来使用しています。 DNAセグメントは、トランスポザーゼ遺伝子を欠くが、カナマイシン耐性遺伝子、R6Kγ複製起点とセグメント^3,4の各端に結合トランスポザーゼのためのDNA配列である2モザイクモチーフを含む。トランスポザーゼタンパク質は、DNA、単独のDNAセグメントに直接添加されているのでトランスポゾンとして定義され、DNA /トランスポザーゼタンパク質複合体は、トランスポとして定義される。トランスポはカナマイシン感受性ホスト（ 図1A）にエレクトロ⁵によって変換される。カナマイシン（LB館）を含有するLB寒天プレート上で増殖したコロニーを、カナマイシン（M-9館）栄養要求株であるを含むM-9培地寒天プレート上で増殖しなかっトランスポゾン挿入（ 図1B）、レプリカプレーティングし、形質転換体（Figireを持つ図1C）。変異体からのゲノムDNAを精製し、部分的に、4塩基切断制限エンドヌクレアーゼ、BFU CI（ 図1D）を用いて消化される。連結したDNAはそれはpir遺伝子 （ 図1E）を含有する大腸菌（E. coli）株に形質転換する。この遺伝子は、新たなプラスミド、トランスポゾンを含有するE.において複製する宿主の染色体領域に隣接することができ大腸菌 ^6。カナマイシン耐性遺伝子は、として機能新しいプラスミドについてelectableマーカー。最後に、中断された遺伝子の同一性を決定するために使用されるトランスポゾンおよび得られた配列の基本ローカルアラインメント検索ツール（BLAST）分析^7,8の各端部に相補的なプライマーを用いて配列決定する。

このトランスポ突然変異誘発戦略は3つの利点^3を提供しています。トランスポゼース蛋白質がトランスポゾンに直接結合されているのでまず、挿入は宿主内のトランスポザーゼ遺伝子の発現に依存しません。トランスポゾンは、宿主ゲノム中にそれ自体を組み込むと、トランスポザーゼはトランスポゾンのさらなる移動を防止する、分解される。ホストは、内因性のTn 5 transpositional要素を有している場合は、追加の動きを防止することができない。第二に、エレクトロポレーションによってトランスポの導入は、多種多様な宿主で使用することが可能となる。また、細菌接合によりやviによってトランスポゾンを導入する必要がなくなりRAL感染。両方のプロセスは、ホストの感受性を必要とする。第三に、カナマイシン耐性遺伝子およびトランスポでR6Kγ複製起点を含めることは、簡単に中断された遺伝子を同定することを可能にする。トランスポゾン中断領域が格納され、遺伝子同定のための逆ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を使用する必要がなくなり、プラスミドのように配列決定することができる。

このビデオで提示プロトコルは、 エンテロバクター属のトランスポゾン突然変異誘発のための各ステップを説明しています。それが中断された推定遺伝子の同定に細菌細胞への導入からトランスポを使っYSU ^9。以前に公開されたプロトコル^-3,4,10-に加えて、栄養要求株をスクリーニングするために、レプリカ平板法を使用するための詳細な方法が提示される。この変異誘発技術は、identのために、細菌の異なるタイプ、例えば抗生物質や金属抵抗など他の表現型を調査するために使用することができる合成生物学研究における定義された培養条件下で増殖に必要な遺伝子の数を最小限に抑えifying、または遺伝学の実験用コンポーネントまたは微生物生理学コースを教えるために。

プロトコル

コンピテントセル^5,11の1.エレクトロポレーション

1. エンテロバクター属のO / NのLB培養を希釈する。 YSU新鮮なLB培地50mlに1/20と0.4と0.6との間のOD（600 nm）に120rpmで、30℃で振盪しながら成長する。必要に応じて、それらの最適な成長温度で、他の細菌株を成長させる。
2. 5分間の遠心分離を4℃で5分間7,000×gで氷上で細胞を冷やす。
3. 、上清を捨て、4℃で滅菌氷冷水および遠心分離機50ml中の細胞を再懸濁し、5分間7000×gで。この手順を繰り返します。
4. 上清を捨て、細胞ペレットの体積に等しい氷冷水の量で細胞を懸濁します。長期保存のため、-80℃、融解氷冷10％（v / v）グリセロール、店舗の等しいペレット体積の氷冷10％（v / v）グリセロール、再懸濁し、10 mlの細胞を洗浄エレクトロポレーションの前に氷の上。
5. 40μlにトランスポの0.5​​μlを添加する細胞。市販のトランスポ液/μlの0.33μgのDNAの濃度で供給される。 0.33μgのが推奨されていますが、0.165μgのDNAが十分です。
6. 氷冷、0.2ミリメートル、エレ​​クトロポレーションキュベット中の細胞/トランスポ混合物を配置し、キュベットの底に混合物をタップします。 25μF、200Ω、および2.5 kVので細胞に衝撃を与える。細胞は冷やし残ることを保証するために、使用前に-20℃の冷凍庫でエレクトロポレーションキュベットを格納します。
7. すぐに、カタボライト抑制（SOC）媒体とスーパーの最適な培養液を滅菌フィルターの960μlを添加する。上下にピペッティングして混合し、滅菌1.5mlマイクロチューブに細胞を移す。
   注：細胞がショック後に死に始めるが、SOC培地中の塩は、それらを回復することができます。節約するためには、トランスポを追加したり、陰性対照細胞を衝撃する必要はない。ちょうどそれに無菌のSOC培地960μlを添加する。
8. 30℃fで細胞をインキュベートまたは120rpmで振盪しながら45〜60分。これは、ホストゲノムと、細胞は、カナマイシン耐性を表現するために再結合するトランスポのための時間を提供します。
9. LB-館寒天プレート上に細胞100μlを広げて、30℃でプレートO / Nインキュベートする。 4℃の冷蔵庫内の残りの形質転換混合物を保管してください。必要であれば、最初のエレクトロポレーション後2週間に後日アップ時の追加金額を広める。

形質転換体の2グリッディング

1. 空の100×15 mmのペトリ皿の蓋にテープグリッドを。 「細菌遺伝学におけるショートコース^"12からグリッドをコピーします。
2. LB-館寒天プレートの底面に線を引きます。グリッドが寒天を通して見えるようにグリッド蓋に固着させるために、テープの小片を使用してください。プレートの底上の線がグリッドの上、中央に整列されていることを確認。テープでプレートを固定することはあってもグリッド化を可能にし、滑りからそれを保つ。ラインは、レプリカめっき後のコロニーの識別を容易にします。
3. 無菌のつまようじを持つ単一の形質転換体を選択し、グリッド内の正方形の中心でそれを見つける。ただコロニーとスポットをタッチします。寒天につまようじを掘るしないでください。プレートを汚染回避するために、一端のみで爪楊枝を扱う。
4. ステップ2.3のように隣接する広場で別の形質転換体を発見。板が一杯になると、30℃でO / Nをインキュベートする。これは、マスタープレートである。

栄養要求性表現型^12を決定するために3.レプリカメッキ

1. LB-館のためのM-9館のためのLB-館のための1、2および3：グリッド化された各プレートについて、1から3の番号3の新鮮な寒天プレートのスタックを作る。使用前に37℃で、逆さまに、O / Nでプレートを乾かします。
2. ステップ2.2のように各プレートの上に線を引きます。
3. 70％エタノールでレプリカ平板ツールを拭き、にレプリカ平板の上に無菌の別珍の正方形を配置オール及び別珍の正方形を取り締まる。手がさえ、それらを洗浄した後に微生物が生息している。その縁によって別珍の正方形を処理することにより、夾雑微生物の導入を防止。
4. クランプに描かれた線とマスタープレート上のラインを合わせ、別珍の正方形の上にプレートを置く。別珍の正方形にプレートから細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。細菌を塗抹しないように注意してください。別珍広場からマスタープレートを外します。
5. クランプ上のラインとプレートの番号1上に引かれた線の位置を合わせ、別珍の正方形の上に置きます。プレートに別珍の正方形から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号1を削除してください。
6. 水のビーカーに別珍の正方形を破棄し、ステップ3.3のようにレプリカプレーティングツール上でクリーン、無菌の別珍の正方形を配置します。このステップでは、画期的な成長と偽陽性の結果を引き起こす過剰接種を防ぐことができます。
7. 整列するクランプ上のラインとプレートの番号1上のラインと新別珍の正方形の上に置きます。別珍の正方形にプレート番号1から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号1を削除してください。
8. クランプ上のラインとプレートの番号2に描かれたラインの位置を合わせ、別珍の正方形の上に置きます。プレート番号2に別珍の正方形から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号2を削除します。
9. プレート番号3を繰り返しステップ3.8第3プレートは、他の二つのプレートのマスタープレートからの完全な転送のための制御である。水のビーカーに別珍の正方形を破棄。 、それらを乾燥、それらを洗ってアルミホイルでラップし、それらを再オートクレーブ、汚染された別珍の正方形を含むビーカーをオートクレーブ、別珍の正方形を再利用するには。
10. 30°CO / Nでプレートをインキュベートする。両方LB館寒天プレート上で増殖するが、M-9館プレート上で増殖しなかったコロニーを栄養要求（あると考えられている図2）。
11. ストリーク外の新鮮なLB-館寒天プレート上にプレート番号1から栄養要求を、30°CO / Nでプレートをインキュベートする。
12. 単離するためのストリーク外の新鮮なLB-館プレート上にステップ3.11においてストリークプレートから3コロニー。 30°CO / Nでプレートをインキュベートする。これは、変異体がよく絶縁されていることを保証します。一つのセクションで各コロニーから3分の連勝にプレートを分割。
13. ステップ2.1から2.4のように、グリッドを形成するために、新鮮なLB-館プレートにステップ3.12から派生画線コロニーからのスポットコロニー。各変異体を三重に再テストされている。
14. 栄養要求の表現型を確認するためのステップ3.1から3.10のように、再びプレートを複製。

4.遺伝子レスキュー

1. 30℃で液体LB館培地でステップ3.13から単離された変異コロニーの3ミリリットルO / N培養を成長。市販のゲノムDNA精製キットを用いて培養液1mlからゲノムDNAを精製する。
2. 0.025 Uの混合物をセットアップするBFU CI制限エンドヌクレアーゼ及び氷上で20μlの反応中/μlのゲノムDNAの1μgの14μlの。 BFU CIは12の異なる部位にトランスポゾンを切断するので、制限エンドヌクレアーゼ、BFA Iまたはそれぞれ二つの3つの異なる部位でトランスポゾンを切断するのHaeIIIを使用することがより効率的である。
3. 25分間37℃で反応をインキュベートし、次に80℃で20分間、酵素を不活性化する。 0.8％アガロースゲル（ 図3）上で部分的に消化されたDNAの3μLを分析します。ゲルの底部まで10キロバイト上から塗抹標本で成功した部分的な消化の結果。
4. 500μlの反応でT4 DNAリガーゼ800単位を使用して部分的に消化されたゲノムDNAを15μlを連結。反応のO / Nにおける4℃をインキュベートする。大きい反応容量は、それ自体、単一の断片のライゲーションを最大化し、二つ以上のDNA断片間の相互作用を最小化する。
5. Precipitateの3 M酢酸ナトリウム、pH 5.5、1mlの95％エタノールを50μl添加し、20分間-20℃でインキュベートすることによって連結されたDNA。
6. 、70％のエタノールでペレットを洗浄、10分間、4℃でDNA及び13500×gでの遠心フュージ真空濃縮器でそれを乾燥させ、およびヌクレアーゼを含まない水10μlにそれを再懸濁します。あるいは、DNAは、空気は、室温で15分間乾燥させることができる。
7. Eを変換するために再懸濁させたDNA4μlのを使用してください部1 R6Kγ複製起点のようにエレクトロポレーションにより大腸菌菌株ECD100DのPIRまたはECD100Dのたpir116は ^6を複製するpir遺伝子を持つ細菌菌株を必要とします。低コピープラスミドにおける菌株pir結果、およびたpir116株は高コピープラスミド結果のpir変異遺伝子が含まれています。各形質転換体は、トランスポゾンと、中断染色体（ 図1E）の領域で新たなプラスミドが含まれています。
8. Inocul単一コロニーを含むLB館培地5mlを食べ、120 rpmで37℃で振盪しながらO / Nを成長し、市販のキットを使用して全体のO / N培養物からプラスミドDNAを精製する。
9. 制限エンドヌクレアーゼのXho Iを用いてプラスミド14μlのダイジェスト反応の最終容量を20μlのあることを確認します。この酵素は、カナマイシン耐性遺伝子の5 '末端におけるトランスポゾンの中央に部位を認識する。未消化10μlのを分析し、0.8％アガロースゲル（ 図3）上でプラスミドを消化し ​​た。プラスミドは、2キロバイトトランスポゾンプラスに隣接する宿主DNAから構成されています。

5. DNAシーケンシング

1. 市販のシークエンスキット、トランスポゾンの各末端に相同なプライマー、およびキャピラリーシークエンシング解析システムを用いてプラスミドを配列決定する。代わりに、プラスミドは、シークエンシングのために外部機関に出荷される場合があります。
2. 分子量標準（1キロバイトラダー）でを使用してくださいゲルは、プラスミドの大きさを推定する。その後、50 fmolのために必要とされるプラスミドのナノグラム（ng）を数を推定。
3. 260nmの_（260）および280nm（A _280）の波長で分光光度計を用いてプラスミドDNAの濃度を測定する。キュベットを通る光路長を確保することは1cmである。 50 ng /μLで260 nmの吸光度を乗じて濃度を決定する。高品質のプラスミドDNAは、1.8と2.0の間で、A ₂₆₀ / A ₂₈₀比を持つことになります。
4. 各配列決定反応のために必要なDNAの量は、プラスミドの濃度で割っ50 fmolのために必要とngの数である。 10μlに全量をもたらすために水で必要なプラスミドの量を混ぜる。
5. 1分間96℃、プラスミドDNA /水の混合物を加熱し、次いでRTに冷却する。
6. シーケンシングキットからマスターミックス8μlのを追加し、配列決定プライマーの1の1.6μMの2μlの。
7. FOLサーマルサイクラープログラムと反応クリーンアップのためのシーケンシングキットからの低プロトコル。
8. キャピラリーDNA解析システムを用いて、各サンプルの分析。
9. DNA配列を表示するには、市販のソフトウェアパッケージを使用してください。トランスポゾン（ 図4）の最後の7塩基対である配列を、「5'-GAGACAG-3 '、」を検索してください。この7 bpのセグメントの5 '末端の前にシーケンスをトランスポゾンに属します。この7 bpのセグメントの3 '末端の後にシーケンスが中断された遺伝子に属します。
10. 基本的なローカル配列検索ツール^{（BLAST）7,8を}使用して中断された遺伝子の可能な機能を決定する。以下を使用link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch .割り込みのシーケンスを貼り付けクエリボックスにED遺伝子は、データベースの「その他」を選択し、ページの下部にある「BLAST」をクリックしてください。結果が表示されたら、アライメント結果（ 図5）を表示するには、ページを下にスクロールします。

結果

エンテロバクター属の形質転換。トランスポとのエレクトロポレーションによるYSUは、宿主ゲノム（ 図1A、B）にランダムゲノム挿入を開始した。成功したエレクトロポレーションは、LB-館のプレート上で増殖した数千の形質転換体が得られた。 300-400を得るためには、プレートあたりコロニーをよく間隔、各LB-館寒天プレート上で形質転換混合物スプレッドの量が最適化?...

ディスカッション

トランスポを使用したトランスポゾン突然変異誘発は、 エンテロバクター属に栄養要求株を生成するための効率的なツールです。 YSU及びグラム陰性菌およびグラム陽性菌^3,4の他のタイプ。プロセスは、エレクトロポレーションによって宿主へのTn 5由来のトランスポを導入することにより開始した。挿入物を有するコロニーを同定するために、形質転換されていない標?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis