中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

要約

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

要約

中心体は、ゲノムの完全性を維持するか、または細胞中の感覚機能を容易にするための一次繊毛を組み立てるために紡錘体の極として機能し、小さいながらも重要な細胞小器官である。タンパク質のレベルは、他の.cellular場所でより中心体で異なって調節され得る、および細胞周期の異なる点でいくつかのタンパク質が中心体のレベルの変化は、中心小体アセンブリの適切な調節のために重要であると思われる。我々は、細胞周期の異なる段階において、または様々な試薬で処理した後、異なる試料からの固定された細胞における中心体におけるタンパク質のレベルの相対的変化を測定する定量的な蛍光顕微鏡アッセイを開発した。このアッセイの原理は、小さな領域でのタンパク質に対応するバックグラウンド補正後の蛍光強度を測定することにあり、そして選択された実験的なCの下で変化しない別のタンパク質のために同じに対してその測定値を正規化するondition。 BrdUのパルスと非摂動細胞周期を研究するチェイス戦略と組み合わせて、このアッセイを利用して、我々は定量的に明確に中心体でプロテアソームを介した分解による可能性が高いVDAC3の中心体のプールは細胞周期の間に中心体で規制されている我々の最近の観測を、検証しました。

概要

中心体は、中心体周辺物質（PCM）に囲まれた中心小体のペアで構成されています。哺乳動物細胞における主要な微小管組織化センター（MTOCs）なので、中心体は、分裂細胞における紡錘体の二つの極として機能するため、ゲノムの完全性^1を維持する^のを助ける。 （G0期の間、例えば 、）静止細胞では、中心体、すなわち母中心小体の二中心小体の一つは、一次繊毛、細胞表面²から突出する感覚細胞小器官を組み立てるために、基礎体に変換される。再入力する細胞周期細胞と、一次繊毛は分解され、各中心小体が徐々に成熟中心小体^3を形成するために伸長するその近位端でprocentrioleの組み立てを指示する。 S期の開始時に、中心小体に9回対称性を提供する車輪のような構造は、既存の各中心小体の表面上に形成され、各procentrioleのベースとなる。 SAS6トン中心小体アセンブリは車輪^4-6のハブを形成するために動員されるために帽子は不可欠である。その他centriolarタンパク質はその後、遠位方法⁷に高度に規制、近位側転上に組み立てられている。正確に中心小体の複製を完了した後、細胞がG2期⁸月末までに二つの機能の中心体を構築するために追加の中心体周辺材料を組み立てる。コアcentriolarコンポーネント^9-11、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、足場成分は、膜結合タンパク質および分解機構を含むいくつかの他のタンパク質に加えて、細胞周期^12-16の異なる時点で中心小体、基礎体とPCMと関連している。それは、多くの場合、多くのタンパク質の中心体のレベルが時間的に中心体標的化メカニズムおよび/または中心体におけるプロテアソーム分解によって調節されることに留意されたい。重要なことは、そのようなPLK4、MPS1、SAS6、およびCP110 A等のいくつかのタンパク質の中心体のレベルの変動細胞周期tの異なる点は、中心小体アセンブリ^5,17-22を調節することが重要であると思われるが、この中心体の劣化を防止MPS1の場合には過剰な中心体¹⁹の形成につながる。一方で、いくつかのタンパク質の中心体画分は、細胞質のプールに比べて少なく不安定である。例えば、siRNA媒介ダウンレギュレーションセントリン2（Cetn2）のは、その全細胞レベル²³で大幅な削減にもかかわらず、中心小体におけるタンパク質レベルの中程度の減少につながった。むしろ、それらの中心体の固有の機能を評価する際に、全細胞タンパク質レベルを測定するよりも、中心体における中心体タンパク質のレベルの変化を測定することが重要である。

本研究では、中心体でのタンパク質の相対レベルを定量化するために、間接免疫蛍光（IIF）を用いたアッセイを開発した。このアッセイは、特に、異なる試料に由来する細胞を分析するために開発されているしたがって、同時に撮像することができない。これらのサンプルは、異なる時点で採取異なる試薬（ すなわち 、薬物対コントロール）で処理した細胞であってもよい（ すなわち 、追跡対パルス）、または細胞周期の異なる段階にある。このアッセイの原理は、背景が小さな領域でタンパク質に対応する蛍光強度を補正し、そのレベルが選ばれた実験条件下で変化しない別のタンパク質に同じに対してその値を正規化するために測定することにある。中心体の生物学におけるいくつかの研究は、最近の候補タンパク質^24-27の中心体の固有の機能を決定するために、両方の生細胞または固定細胞内の様々な定量的な顕微鏡技術を利用している。これらのアッセイと同様に、本技術は、試験タンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を測定する。しかし、このアッセイにおいて内部標準を使用して正規化を含めることは、おそらく大きな提供するであろう二つの異なるカバーガラス上で2つの異なるサンプルを分析の精度と信頼。また、中心体におけるタンパク質レベルを調べることに加えて、微調整して、この方法は、実験条件の多様なセットに、または他の細胞の部位に適用することができる。

ここでは、異なる細胞周期段階の細胞を比較するためのBrdUパルスチェイス戦略我々の定量的顕微鏡アッセイを組み合わせる。代わりに、様々な細胞周期の時間点を研究するために非同期的に増殖している細胞を、標準的な細胞周期停止および放出技術を使用してのS期における細胞を標識するためにBrdUでインキュベートし、標識された細胞は、種々の時間（通常は4-6時間）のために追われている。標識された細胞のほとんどは、直ちにパルスの後にS期になります。チェイスした後、標識された細胞は、のnucに対する中心体の形態学的特徴などAS-位置によって確認することができる後期S、G2または有糸分裂になるように、チェースの長さが選択されるレイ、中心体の間の距離は、 その他の染色体の凝縮したがって、チェイスの長さはS、G2、および特定の細胞型のM相の平均持続時間に依存する。このアプローチは等ヒドロキシ、アフィジコリン、ノコダゾール、細胞周期阻害剤を回避するので、より生理学的に関連する細胞周期分析を可能にする。

従って、我々は、単独で、定量的蛍光顕微鏡アッセイ、またはBrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせて、正確に非摂動細胞周期の間に候補タンパク質の中心体のレベルの相対的変化を測定するためのシンプルかつ強力な技術であることをここで実証する。我々は、これらのアッセイを用いて、VDAC3の中心体レベル、我々は最近、ミトコンドリア^16,28に加えて、中心体で同定されたタンパク質を測定した。結果はVDAC3の中心体のプールが劣化することによって調節されることを我々の以前の観察を確認し、ここで得られ、また、細胞周期dependenで変化トンの方法^16は 、さらに、この方法の適用性を検証する。

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プロトコル

1.細胞培養

1. 逆転写酵素（hTERT）ヒトテロメラーゼを使用して網膜色素上皮細胞の不死化酵素（hTERT-RPE1は、RPE1としてここで呼ばれる）。
   NOTE：RPE1細胞は一般に中心小体アセンブリと繊毛形成を研究するために使用される近二倍体、非形質転換ヒト細胞である。これらの細胞は、細胞周期調節と調整通常の中心小体複製サイクルに従ってください。
2. 継代1においてRPE1細胞のほぼコンフルエント100ミリメートル細胞培養皿：10 mlを含む新鮮100mm皿に元の培養の5希釈DME / F-12（1：1）培地、10％ウシ胎児血清を補充した（FBS）、100 U / mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシン（完全培地をDME / F-12培地と呼ばれる）。 5％CO ₂存在下、37℃で細胞を増殖させる。
   1. 水浴またはインキュベーター中で60℃で、振盪せずに覆われたガラスビーカー、O / Nでの1N HCl 50mlに12ミリメートルラウンドガラスカバースリップをインキュベートする。
   2. AF酸性溶液を廃棄terを、時々振とうしながら15分間インキュベートすることにより、蒸留水100mlに、カバースリップを3回洗浄する。 70％エタノールおよび95％エタノールで同様に洗浄を繰り返す。
   3. 個別に60分間紫外線照射による滅菌が続くバイオセーフティキャビネット内の実験室ブロッティングペーパー、上に広げることにより、カバースリップを乾かします。
3. 35ミリメートルの細胞培養皿に2-4ドライカバースリップを置きます。細胞培養物をPBS中の25μg/ mlの濃度になるように操作された重合体（1 mg / mlのストック濃度）などのフィブロネクチンまたはフィブロネクチンの溶液を希釈する。
   1. 各カバースリップ上に希釈溶液の80〜100μLを置き、コーティングするために60分間カバースリップの上側をインキュベートする。完全培地を追加する前にPBSを用いて三度カバース​​リップを洗ってください。

2.成長する細胞とプロテアソーム阻害剤で処理する細胞

1. 通路2×10 ⁵非同期的に成長するカバースリップを含む各35mm皿にRPE1細胞るし、2mlの完全培地中で細胞を増殖させる。新鮮予め温めておいた完全培地で培養液を24時間毎に交換してください。
   1. 試験タンパク質が中心体のレベルでプロテアソーム阻害の効果を分析するために（ここでVDAC3またはγチューブリン）は、44時間、2つの35mm皿で細胞を増殖させる。完全培地で培養液を交換し、それぞれ5μm以上0.05％の最終濃度で制御溶媒としてMG115またはDMSOのいずれかを追加します。同時に、40μMの最終濃度で細胞にBrdUを追加し、4時間細胞をインキュベートする。
   2. 24ウェルプレートの各カバースリップを転送します。各ウェルに500μlの冷メタノールを加え、10分カバースリップ上で細胞を固定するために、-20℃でプレートをインキュベートする。すぐに500μlの洗浄緩衝液（0.5mMのMgCl ₂および0.05％のTriton-X 100を含む1×PBS）を用いてカバースリップを3回洗浄する。
2. 残留を収穫35mm皿と遠心分離機で5分間千xgで細胞から。ウェスタンブロッティング（ステップ6）、総タンパク質を分析するために細胞ペレットを使用する。

3. BrdUのパルスチェイスアッセイは、異なる細胞周期中のタンパク質レベルを分析するには

1. 44時間カバーガラスを含む二つの35mm皿で細胞を増殖、細胞周期の異なる段階において中心体にタンパク質（ここでVDAC3、SAS6またはCep135）のレベルの変化を分析する。 40μMのBrdUを含む完全培地で培養液を交換し、細胞培養インキュベーター中で4時間細胞をインキュベート。
2. 1皿から、ステップ2.1.2で説明したように冷メタノールを用いて細胞を固定し、24ウェルプレートにカバースリップを転送する。
3. 4時間のBrdUのパルスの後、BrdUを含む培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄し、完全培地で1回、さまざまな時間（通常は別の4時間のBrdUの不在で細胞を新鮮な培地を追加し、成長するRPE1細胞）ステップ2.1.2で説明したように細胞を固定する前に。
   注：RPE1細胞では、BrdU陽性細胞の大部分は、4時間のチェイスの後に遅れてSまたはG2期にある。これは、各細胞型のために独立して決定されなければならない。

4.免疫染色

1. 30分間（1×PBS中の2％BSA、0.1％トリトンX-100）をブロッキング緩衝液200μl中のカバースリップ上に固定された細胞をインキュベートする。
   1. 加湿チャンバー内で4℃でバッファー·O / Nをブロックで希釈した一次抗体（ウサギやマウスで育ち別で育った、通常1）の組み合わせで細胞をインキュベートします。
   2. 加湿チャンバーを作るために、空の千μlのピペットチップボックスの下半分に湿ったペーパータオルを置く。ラック表面にパラフィルムのストリップを置き、インキュベートされる各カバースリップのためにパラフィルム上に抗体溶液の液滴（15〜20μl）を見つける。抗体溶液の液滴の上にカバースリップを反転（セルが浸漬されるように）とclose先端ボックスの蓋。
   3. 再びカバースリップを反転し、24ウェル皿に戻ってそれらを返す。カバースリップを洗浄した後、室温で1時間（緑色蛍光色素結合抗ウサギおよび赤色蛍光色素結合抗マウスブロッキング緩衝液で希釈したここに）150μlの二次抗体の混合物でそれらをインキュベートする。カバーガラスを3回洗浄します。
      注：フォア結合二次抗体は、光に敏感である。ステップの間に光からサンプルを保護する4.1.3-5.1.2。
2. ステップ2.1.2で説明したように、10分間-20℃で500μlの冷メタノールで再染色RPE1細胞を固定することにより抗BrdU染色のために準備します。三度カバース​​リップを洗ってください。
   注：この固定は、次の工程において酸加水分解プロセスの間に、目的のタンパク質の一次および二次抗体標識を固定する。
   1. 室温で30分間2 N HClを200μlの細胞をインキュベートする。 1MトリスClを300μlの、pHが8で中和洗浄緩衝液を用いて細胞を3回洗浄しdは。
   2. 再び室温で30分間ブロッキング緩衝液を200μl用いて細胞をブロックする。
   3. 加湿チャンバー中、37℃で45分間（ブロッキング緩衝液で希釈）、ラット抗BrdU抗体で細胞をインキュベートする。バック24ウェルディッシュにカバースリップを返し、それらを洗浄した後、室温で1時間24ウェルディッシュにブロッキング緩衝液150μlの希釈された青の蛍光色素結合抗ラット二次抗体（でインキュベートする。
3. カバーガラスを3回洗浄します。ガラス顕微鏡スライド上に退色防止試薬を含むマウントソリューションの滴（約3-6μl）をスポット。取り付け溶液上に、細胞側を下にして、カバースリップを反転。優しくソフトなクリーニングティッシュを使用して、スライドに対してカバースリップを押すことにより、余分な液体を拭き取ります。顕微鏡スライド上にそれを密封するためにカバースリップのエッジに沿って透明なマニキュアを適用します。

5.免疫蛍光画像Acquisitionと分析

1. 周囲温度で、BrdU陽性RPE1細胞の画像を取得する（1.4の開口数を有する）100Xプランアポ油浸対物レンズを使用する。
   1. デジタルイメージング可能なカメラを取り付けた顕微鏡（機器を参照）にスライドを置く。各蛍光団のために、手動での実験のすべてのサンプルを検査することによって（通常は300〜1,000ミリ秒の間）、適切な露光時間を決定する。細胞の画像を取得する前に、手動でZ軸（通常は0.2μmのステップサイズ）に沿って適切な上部と下部の焦点面を決定する。デジタル顕微鏡イメージング·ソフトウェア·パッケージを使用して、Z軸に沿った異なるフルオロフォアに対して同一の露光時間を用いて、別個のカバースリップ上にある異なる試料の画像を取得する。
2. Z軸に沿って取得したすべての画像スタックの（無傍アルゴリズムを使用していないこれらの場合）デコンボリューションを行う。
   1. に沿った各画像スタックの全強度投影を取得するZ軸。
3. 中心体は、（2中心体の間の距離が2μm未満である）近くにある細胞では、両方の中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。
   1. 最初の広場を囲む大きな平方（片側通常は24〜35ピクセル）を描き、大きな正方形の選択した領域をマーク。
   2. 領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を得る（Sは小箱を表し、Lは、大きなボックスである）。
   3. 背景ハウエルらによって記載の式を用いて、各フルオロフォアの蛍光強度を補正し、分析^29：F = F _S - [（F _L - F _S）はS /（ - _{S L）×]。}
   4. そのflのバックグラウンド補正された蛍光強度の比を計算することにより、目的のタンパク質（ここでVDAC3またはSAS6）の正規化された蛍光強度を得る（ここでγチューブリン、SAS6またはCep135）選択した内部標準用に使用される蛍光団のものとuorophore。
4. 中心体が十分に分離された細胞を分析する場合には（二中心体の間の距離が2μm以上である）、箱の二つの別々のセットを描くことによって個別に中心体を分析する。各中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は15〜25ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。最初の広場を囲む大きな平方（辺あたり20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。
   1. 領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を取得し、ステップ5.3.3で説明したように、それぞれの中心体に別々に、各蛍光体のバックグラウンド補正された蛍光強度を算出する。
   2. そのセル内のそのタンパク質の合計中心体のレベルを得るために、2つの中心体からそれぞれのタンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を組み合わせる。
   3. 入手する内部標準の合計中心体の強度、その合計中心体の強度の比を計算することにより、目的のタンパク質のための正規化強度。
5. 各実験条件のために、少なくとも15〜25の細胞を分析し、スプレッドシートのグラフをプロットします。

6.ウェスタンブロッティングを使用して総タンパク質の分析

1. 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1％ノニデットP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む（RIPA）緩衝放射免疫沈降アッセイで細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする細胞を溶解する。
   1. 遠心分離機で10分間、10,000×gで混合、ペレット画分から溶解物を分離し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイキットを使用して、各溶解物の総タンパク質濃度を測定する。
2. 4×SDS-PAGEローディング緩衝液（50mMのトリス-Cl、pHは6.8、2％SDS、10％グリセロール、100mMのジチオスレイトール、0.1％ブロムで溶解物40μgのを混ぜるophenol青）。
   1. 10分間サンプルを沸騰し、200Vの定電圧でSDS-PAGEを変性12.5％でサンプルを実行する
3. （低温で1時間、90 Vの定電圧で）ウェスタンブロッティング技術を使用してニトロセルロース膜にSDS-PAGE上で分離したタンパク質を移す。
   1. 1×PBS中3％脱脂乳で膜をブロックし、次いで1のため（この場合はウサギ抗VDAC3、ウサギ抗γチューブリンおよびマウス抗αチューブリン）に希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートするRTで時間。
   2. PBS-T緩衝液（1×PBSおよび0.2％のTween-20）を用いて膜を3回（振盪下で各5分間のインキュベーション）を洗浄した後、近赤外（IR）の混合物で膜をインキュベートする蛍光色素結合抗ウサギおよび1時間（PBS-Tで希釈した）IR蛍光色素結合抗マウス二次抗体。
   3. 膜を3回洗浄した後、赤外線を使用してfのバンドを分析するために、膜をスキャンイムノブロット検出に適しluorescence撮像システム。

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結果

我々の最近の研究ではVDAC3、ミトコンドリアのポリン^16,28の1の新規中心体の局在と機能を同定した。 VDAC3特異的抗体を用いたRPE1細胞を含むいくつかの哺乳動物細胞の免疫染色は顕著な中心体染色および比較的弱いミトコンドリアの染色を示した。また、中心体VDAC3が優先母中心小体、および内因性の両方の中心体のプールに関連し、異所性にVDAC3が劣化¹⁶によって調節されて発...

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ディスカッション

細胞生物学における定量的な顕微鏡は、一般的に固定するための別の定量的顕微鏡アッセイを開発細胞生物の成長の例がある。しかし、 等 、（FRAP）光退色後にそのような蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、蛍光の回復などの生細胞イメージングアッセイに関連している近年の細胞^27,34-36。重要なことは、中心体生物学を理解する上での進歩は、多くの場合、中心体のプールは?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter