in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

要約

このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。

要約

昆虫病原性線虫（EPN）（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）は 、腸内細菌科にグラム陰性ガンマプロテオバクテリアと共生のパートナーシップを持っている。 フォトルハブダスは heterorhabditidsの共生している間Xenorhabdus細菌がsteinernematids線虫に関連付けられています。一緒線虫や細菌は親密で、特定の提携で昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体を形成する。ここで、私たちは、生体内で 、一般に実験室条件下で、これらの線虫の飼育に使用されるインビトロ技術で実証している。さらに、これらの技術は、EPN培養の確立に成功するための重要なステップを表し、また、研究のために、これらの生物を利用する他のバイオアッセイの基礎を形成する。 aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の生産は、多くの場合、深いと共生の研究に多面的なアプローチのために重要である。このプロトコルは、抗生物質の添加を必要とせず、標準的な実験装置を用いて短時間で行うことができる。貯蔵におけるそれらの生存が使用される種に依存して変化し得るが、このようにして製造線虫は、比較的ロバストである。このプレゼンテーションで詳述技術は、P株価の研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）により、さまざまな著者によって記載され、洗練されたものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

概要

昆虫病原性線虫（EPN）SteinernemaとHeterorhabditis属 。 （Steinernematidae、Heterorhabditidae）とそれらの細菌の共生、XenorhabdusとのPhotorhabdus属（腸内細菌）が陸生動物-微生物共生関係^{2-4,6,10,19。Xenorhabdus}とのPhotorhabdus属の創発モデルと考えられている。また、感染性若年性（IJ）として知られている線虫の唯一の自由生活段階、または^第3段階感染幼若^8,10,13の腸内に共生として保有されている。細菌線虫ペアは昆虫の広い範囲の病原性であり、成功裏に^6,8、世界中の生物学的制御と統合された害虫管理プログラムに実装されています。

ここで私たちは、生体内で 、頻繁に実験室条件下でEPNの飼育のために行使されたインビトロ技術での選択を示している。 私をnは、生体内の方法は、線虫の飼育用の昆虫宿主を企図している。通常、さまざまな昆虫の受注（ すなわち鱗翅目 、 甲虫目 、 双翅目 、 等 ）の未成熟な段階は、適切なホストとみなされます。メソッドは、通常、実験室での線虫の培養物の維持のために考慮されるインビボ 。線虫の量産を考慮した場合、この方法は適切でないかもしれない。昆虫宿主の大量のは、より多くの時間と昆虫飼育に関連する追加費用を要求して、この目的のために必要な場合があります。

昆虫病原性線虫には、いくつかのメディアに対してインビトロで培養することができる。研究の目的に応じて、 インビトロ法で 、またはメディア内共生細菌の混入を考慮することができる。この発表では、EPNの伝播のための2つの一般的に使用される方法が記載されている。培地の成分は、共生細菌aの栄養素の供給源を提供ND線虫用のステロール源。 インビトロ法は、昆虫宿主なしで優位にEPNの飼育を提供します。

適切な昆虫宿主が利用できない場合、もともと開発されたインビトロでのメディアの多くは、EPNの乗算のために使用した。しかし、過去数年間にわたり、in vitroでの飼育方法が広くEPNとその共生細菌^17,19間の共生関係を理解することを目指して研究に採用になっている。

このプレゼンテーションで詳述技術は、さまざまな著者によって記載され、証券研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）によって洗練ものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

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プロトコル

彼らのSymboitic細菌と昆虫病原線虫の1。 インビボ飼育

1. 100×15ミリメートルのプラスチックシャーレを反転し、皿のふたにろ紙（90ミリメートル）の2つのディスクを配置します。
2. 均等に濾紙上（1,000〜2,000 IJ / mlの濃度で）IJ（感染少年）水懸濁液1mlを分配する。
   注：IJSは表面殺菌する必要はありません。
3. 皿に大きなwaxmothのハチノスツヅリガの10終齢幼虫を追加します。目標は、約100〜200 IJS /幼虫を提供することにある。
4. ペトリ皿（ 図1）の底部とふたをカバーし、ペトリ皿にラベルを付ける。以下の情報に言及：線虫種名（既知の場合）;コー​​ド/指定を隔離する。日付感染トラップが設定されました。
5. （水分を節約するために）緩く密封されたビニール袋の中に皿を置き、どちら室温または20〜25℃の間のインキュベーター内で暗所に保管してください。毎日の料理をチェックする
   注：それは土壌中に自然感染状態を模倣として闇は、線虫の感染を容易にします。
6. 3〜5日後に、変更されたホワイトトラップ⁷への線虫感染の兆候で死体を取り除く。
   注：死体が腐敗の臭い場合、これは培養が成功しなかった、および/または汚染があったことを示す可能性があります。線虫および昆虫の新しいバッチで新しい感染室を設定します。

彼らの共生細菌を持つ昆虫病原線虫の2 のin vitro飼育

1. 肝臓、腎臓天法^9,19
   1. 小片（2 cm ³程度以下）に肝臓と腎臓をみじん切りにし、NaCl、寒天と水300mlでブレンダーに入れ、肉が液体パルプ、濃厚なペーストやピューレになるまでブレンドする。その後、1 Lの三角フラスコに移し、混合物。
   2. ブレンダー容器に水の最終200ミリリットルを加え、中に残っているメディアをデカント三角フラスコ。 121°Cで15分間オートクレーブ。許可オートクレーブ後の寒天注ぐ前に触れて冷却する。
      注：この培地は、肉の塊を持っている傾向があるため、媒体のピペッティングは推奨されません。
   3. 手の攪拌または間の三角フラスコを旋回がより均質なメディアに注ぐながら5（または6）cmのペトリ皿に寒天〜20ミリリットルを注ぐ。必要になるまで寒天は4℃で固化し、店の食器を許可する
      注：ペトリ皿に注ぎ、肉のいずれかの大きな塊を破壊する火炎滅菌金属スパチュラを使用してください。
2. 脂質天法^9,19
   1. 栄養ブロス、寒天及び酵母エキスを一緒に混合することにより、脂質寒天培地を準備し、2リットルの三角フラスコに混ぜ注ぐ。 121℃で15分間、H ₂ OおよびMgCl _{2•6H 2} O、オートクレーブ蒸留追加。
   2. コー​​ン油、コーンシロップミックスの無菌ミックスを加え、攪拌または均等に油滴を分散させるために積極的かつ頻繁に渦巻く。
      注：UVクロスリンカーに必要な容積を配置することによって、コーン油及びシロップを滅菌する。オイルが液体に溶解するが、それは小さな液滴中にあることを確認することはありません。
   3. 5（または6）cmのペトリ皿上に〜20ミリリットル寒天を注ぎ、必要になるまで寒天4℃で固化し、店の料理をすることができます。
   4. ストリークは、脂質寒天プレートに共生細菌を希望し、24〜48時間、28℃でプレートをインキュベートする。
      注：一晩（12-16時間）のLBサブカルチャーの100〜200μlのスプレッド。
   5. 翌日は、約0.4ミリリットル表面殺菌し、線虫懸濁液（卵や感染少年）のを追加し、暗いまたは22±3℃のインキュベーター内で、室温でプレートをインキュベートする。
      注：それは、線虫の成長に好ましくない過度に湿潤環境を作成することができますように線虫懸濁液を超える0.4ミリリットルを追加しないでください。
   6. 毎日文化を監視します。培養物は、約12日間（ 図2）にIJSの新世代を生成する必要があります。
   7. 線虫が変更ホワイトトラップにディッシュ（ 図3A）の側面をクロール見ているときIJS（ 図3B）を収穫する（オロスコら ¹²参照）寒天でボトムディッシュを転送します。メディアの汚染を減らすために、層流フードの下に、この手順を実行します。
   8. 出現時に変更されたホワイトトラップからIJSを収集し、あらゆる媒体破片を除去するIJサスペンションをすすぐ。ストア（コールド温度インキュベーターまたは低温室）で10℃での滅菌蒸留水にIJまたは必要に応じてすぐに使用しています。
      注：研究の目的に応じて、シンビオント·保菌またはaposymbiotic線虫のいずれかでプレートをシード。

3 インビトロ Aposymbioticの飼育（共生フリー）昆虫病原線虫

1. 10-20 G.に感染希望線虫種のIJSとmellonella幼虫 （セクション1を参照）。 3または4日後（この時点でIJSは成熟しているはず第一世代の成人に）死体を収集します。
   注：卵の適切な数を得るために必要な雌の成熟度と数に時間が種によって異なります。より多くのGを感染させるmellonella幼虫必要であれば、彼らは右の発達段階にあるかどうかを評価するために、早ければ48時間後に感染症などの解剖を開始します。
2. 生理食塩水（M9バッファ^18）とのペトリ皿に個別に死体を置きます。先端の細い鉗子で頭を引いて、死体を解剖。
3. 細い針（好ましくはL字型）で、少なくとも20（内側卵）妊娠、女性を集め、M9バッファー（ 図4A）の10ミリリットルを含む時計皿に置いてください。
4. 以下の成分を考慮してaxenizing溶液を調製：蒸留水6.75ミリリットル、1.25ミリリットル5NのNaOH、および2.25ミリリットルの市販の漂白剤溶液を3％の次亜塩素酸を希釈した。
   注：NaOHを塩基性溶液、手袋、ゴーグルや他の適切な保護である衣服は着用してください。
   注：漂白剤は、光の中で分解する、新鮮なaxenizing液を毎回準備します。 axenizing液のいくつかのバッチを用意し、複数の時計皿に卵の表面殺菌や収穫を行う。
5. M9バッファは緩衝液で時計皿を充填し、ピペットを用いてバッファを吸い取って、女性には少なくとも3回洗浄します。女性は時計皿に残っていることを確認します。このステップをさらに2回繰り返します。
6. すぐにaxenizingソリューションを追加し、女性は10〜15分を超えないために、この溶液中に残存することができます。 （axenizing液に抵抗性である）卵は無傷のままでいる間に崩壊し始めて線虫の組織を観察します。
7. 手動で針またはメス（ 図4B、C）でそれらを切断することによって、プロセスをスピードアップするために女性の身体を破壊する。未溶解組織を加える避け、1.5mlのマイクロチューブにそれらをピペッティングすることにより、卵を除去します。
   注：Mとして使用卵を収集し、卵の生存能力として、迅速に作業するために、必要に応じて、任意のマイクロチューブはaxenizing溶液への曝露の長期間にわたって減少します。
8. 「高速設定」を使用して15秒間ボルテックスチューブは、更に、卵に付着線虫組織を除去した。別の方法として、渦が利用できない場合、解決策を上下にピペットを数回。
9. で約18000グラムで2分間の遠心分離によってペレット卵。卵は十分にペレットされない場合は速度を上げてください。 axenizing液を取り出し、1分間900×gで滅菌蒸留水と遠心機1のより多くの時間をマイクロチューブに充填することにより二回すすいでください。
10. 最後の洗浄後、滅菌蒸留水300〜500μlの卵を再懸濁し、滅菌3センチメートルペトリ皿または滅菌時計皿に置いてください。卵は今表面殺菌であることを忘れないでください、そう卵の清浄度を維持するために、滅菌ピペットおよび/またはpippetterのヒントや水を使用しています。
11. 彼らは（ 図4D）は無傷であることを確認するために解剖顕微鏡（30-50X倍率）の下で卵を調べ、肝臓、腎臓寒天と5cmのプレートに移す（セクション2.1を参照）
    注：それは寒天が過度に濡れになりますので、プレート上の卵の懸濁液の400以上のμLを追加しないでください。
12. 適切な情報をラベルプレート、28℃の暗所で直立に格納します。卵の孵化することは明白で、一晩でなければなりません。
    注：水は皿の蓋の上に凝縮することがありますが、それは1日または2日後に蒸発する。この時、寒天の水分を保持し、その乾燥を避けるために、ビニール袋に皿を置く。
13. 定期的に料理を守り、真菌や細菌汚染の兆候を示すあらゆる料理を捨てる。 IJSがペトリ皿の壁を移行見たら、ふたを取り外して、修正されたホワイトトラップ¹²に寒天でボトムディッシュを転送します。 modifieに皿を転送する際に、無菌状態を考慮してくださいdはホワイトトラップが露出メディアの汚染を回避する。
14. 必要に応じてホワイトトラップと収穫IJの​​監視を続けます。
    注：Aposymbiotic線虫は何日あっても数週間ホワイトトラップの水の中に移動していきます。

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結果

in vivoでの飼育方法は、線虫の成長と再生のための宿主としてのライブ昆虫を使用しています。感染室は昆虫のIJSを露出させるための効率的な方法である。これは別の昆虫宿主から細菌共生ベクトル線虫のライフサイクルにおける唯一のステージである。1は感染室だけでなく、このチャンバーを構築するために必要な材料のために設定示しています。 イン?...

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ディスカッション

適当な宿主を使用すると、EPNの生体内で飼育することに成功するための重要な要因である。通常、両方steinernematidsとheterorhabditidsを再現することができますし、正常に高いワックス蛾、 ハチノスツヅリガ （鱗翅目：メイガ）の幼虫で、そのライフサイクルを完了。しかし、異なるファミリーおよび/または指図から他の昆虫種が考えられる。現在記載され線虫種のいくつか...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infections
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella are recommended
For Liver-kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092
Beef liver, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef kidney, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)	Acros/VWR	200002-434	any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
500 ml distilled H2O
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Nutrient broth, 8 g	BD/VWR	90002-660
Yeast extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Corn oil, 4 ml	Any brand	Locally source; supermarket	Any brand of corn oil can be used
Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity	Karo	Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
Distilled H2O, 890 ml