T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

要約

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

要約

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

概要

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

プロトコル

培養培地、サイトカインおよび糊化プレートの作製

1. 高グルコースおよびピルビン酸ナトリウムをイーグル培地（DMEM）のダルベッコ改変を使用することにより、ES細胞培地を準備します。 ESC認定ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％HEPES緩衝液、1％非必須アミノ酸、0.1％ゲンタマイシン（50 mg / ml）を、0.1％の（20％の追加55μM）、β-メルカプトエタノール。濾過によってES細胞培地を滅菌する。
2. メーカーの指示に従って粉末からアルファ最小必須培地（α-MEM）を1LにすることによってOP9メディアを準備します。 20％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを追加する。混合する反転。 2 500ミリリットルのアリコートに濾過することにより滅菌する。
   注：粉から作られたメディアの使用が推奨され、改善されたOP9細胞の維持およびインビトロ分化結果にをもたらす可能性が高い。このアプローチは、私たちの標準的な手順となっている。しかし、私たちは股関節の点に注意してくださいT私たちは常に、十分な成功を収めて事前に作成された液体のα-MEMを用いてきた。
3. 90％FBSを10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地の準備。優しく旋回し、濾過により滅菌する。 4℃で保存。
4. を10μg/ mlに完全なOP9培地中でヒト組換え体Flt-3リガンド（FLT-3L）を溶解することにより2,000x FLT-3リガンド（10μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存に関する供給業者の推奨事項に従ってください。
   NOTE：のFlt-3Lの安定性（4℃または3ヶ月間-80℃で1ヶ月間）に短い。
5. 完全なOP9メディアを使用して1,000倍のIL-7（1μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存上の供給元の推奨に従ってください（IL-7は、-80℃で12ヶ月まで安定である）。
6. LIF iの10 ⁷単位の1:10希釈により1,000倍白血病抑制因子（LIF）（10μg/ mlの）を準備nはES細胞培地。 4℃で保存一定分量。分量バイアルにメーカーが提供する有効期限に注意して。
   注：製品は、製造日からの濃縮または希釈された形は少なくとも18ヶ月で安定している。
7. 6ウェルプレートの各ウェルに0.1％ゼラチン溶液1.5mlを加えることにより糊化6ウェルプレートを準備する。コー​​ティングのために少なくとも30分を可能にする上で蓋を室温で無菌フード内で料理をしておきます。皿はまた、加湿インキュベーター中で一晩放置してもよい。右の細胞播種の前に残っゼラチン溶液を除去します。ゼラチン溶液を完全にウェル内に乾燥させてはいけない。

フィーダー細胞とマウスの胚性幹細胞の調製とメンテナンス（MESC）

注：5％CO ₂の加湿した37℃のインキュベーター内のすべてのセルをインキュベートする。

1. 解凍マウス胚線維芽細胞（MEF）
   1. 凍結バイアル（〜5×10 ^6をクイック解凍細胞/バイアル）および15 mlチューブに移す。
   2. 次第に凍結媒体からのDMSOを希釈して滴下方式で、解凍された細胞へのES細胞培地を8mlを追加します。
   3. 5分間、4℃で400×gで遠心分離した細胞。上清を慎重に除去し、ES細胞培地3mlに細胞ペレットを再懸濁する。
   4. 予め温めたES細胞培地の33ミリリットルと50ミリリットルの遠心管を準備します。 36ミリリットル最終容量をもたらすために、再懸濁したMEFの3ミリリットルを追加します。
   5. 2糊化6ウェルプレートの各ウェルに再懸濁させたMEFの3ミリリットルを配布します。細胞が付着し、その上にたmESCを播種する前に広がることができるように、少なくとも6時間インキュベーターにプレートを置きます。彼らのメディアは2〜3日ごとに変更された場合は、これらの有糸分裂逮捕フィーダー層は、最初の播種後数日間使用可能であってもよい。
      NOTE：新鮮逮捕MEFを使用することもできる。
   6. 播種たmESC
      1. 37℃の水浴中の凍結MESCクローンでバイアルをクイック解凍し、2.1.1-2.1.3に記載されているように細胞を調製する。
         注：私たちは、6ウェルプレートのコンフルエント井戸からMESCの2バイアルを凍結する。
      2. 逮捕MEF単層（ステップ2.1.5で調製）で6ウェルプレートの（MESCクローンあたり）つのウェルから培地を除去し、MEF単層の上にたmESCの3ミリリットルをシード。 1,000倍LIF（10 ng / mL）を、3を添加する。インキュベーターに皿を返します。
   7. ES細胞の維持およびトリプシン仲介通過
      注：MESCの合流点に基づいて、日単位のメディアを変更し、または分割。最適には、収穫および分割/再プレート細胞隔日。
      1. ES細胞培地を除去し、PBS 2mlでたmESCを洗う。 PBSを除去します。 0.25％トリプシンを1mlを加え、3〜5分間37℃でインキュベートする。
      2. トリプシン処理した細胞を収集し、15ミリリットルの遠心管に転送します。激しくメートルの塊を破壊するために、細胞懸濁液をピペットESCは。トリプシンを中和し、細胞懸濁液に完全なES細胞培地2 mlを加える。
      3. 4°Cで5分間400×gで細胞をスピン。上清を除去し、3ミリリットルのES細胞培地でペレットを再懸濁します。
      4. 準備逮捕MEF単層を含む6ウェルプレートから培地を除去。播種するために、各ウェルにES細胞培地3ml中の（所望の分割比に基づいて）細胞懸濁液の適当な量を加える。 1,000倍LIFの3を添加する。うまく分割コンフルエントMESC 1：図6は、2日間で通過させるための準備が整います。
   8. OP9 / OP9-DL1細胞の維持
      1. OP9細胞のバイアルを解凍（手順に従って2.1.1-2.1.3 OP9メディアを使用）
      2. 10cmの組織培養皿に7ミリリットルのOP9メディアを追加します。プレート全体に細胞を分配、一滴ずつの方法で再懸濁した細胞の3ミリリットルを追加します。インキュベーター内で一晩細胞を配置します。
      3. 翌日OP9細胞の合流点を確認してください。料理は多くの死んだ浮遊細胞が含まれている場合は、レモメディアVEの、新鮮なOP9メディアの10ミリリットルを追加します。ほぼ完全な合流点が観察されていない場合、インキュベーターに皿を返します。 4近くコンフルエントOP9単層：スプリット1（トリプシンを用いて）。
         注：プレートを約2日後にもう一度同じ合流レベルに達する必要があります。 OP9細胞が過コンフルエントになるさせないように注意してください。
      4. 拡張ストックとしてOP9細胞の初期の継代をフリーズします。
         注：私たちはコンフルエント10cmディッシュに近いものからOP9細胞の2のバイアルを凍結する。拡張ストックの各バイアルは、さらに後述MESC共培養実験で使用されるワーキングストックを作成するために増殖させることができる。変動温度はマイナスのフリーズの品質に影響を与える可能性があるので、むしろ-80℃の冷凍庫でも液体窒素中で凍結し、すべてのOP9ストックを保管してください。

   3 OP9-DL1共培養手順

   1. 共培養の準備
      1. 約1週間前に、共培養の開始に、MEFは、たmESCとOP9細胞作業STO解凍CKS。 OP9-DL1細胞を共培養8日目までは必要としないことから、共培養開始後の最初の3日間OP9-DL1細胞を解凍。必要に応じて、すべての細胞を維持または凍結。
      2. 実験の規模に基づいて共培養0日目に80％のコンフルエンスに到達するために用意OP9細胞単層を10cmプレートの最初の数を決定する（ 例えば 、MESCクローンの数は、に分化し、共培養の時点の数する）を分析すること。 2日後に控え単層が必要とされるときの6：4と1：共培養の準備をするために、1との間でOP9細胞のコンフルエント皿の近くに分割します。
         注：一つは、ESCクローンごとに少なくとも1つのプレートが必要になります。 （以下に記載するように）一般的に、単一のESCクローンは0日目に、単一のプレートに播種し、5日目の通路で6枚のプレートに播種するのに十分な細胞が得られるはずです。毎日5板は、1次の分析の時刻が有効になります。
      3. OP9単層を継続的に共培養継代のために必要とされるので、常にmaintaに注意してください共培養と並行して、追加のOP9培養プレートの十分な数の。
   2. 0日目：共培養の開始
      1. 2.3.1-2.3.4のようMESCを収集します。細胞を数える。
      2. 各MESCクローンの場合はプレート当たりOP9培地10ml中に5×10 ⁴ MESCを準備します。
         注：私たちはそれを使用していないが、私たちは代替α-MEMからなる培地、10％のFBS、5×10 ^-5 Mのβ-メルカプトエタノールも分化共培養の使用が報告されていることに注意してください^10。
      3. OP9皿から古いメディアを取り出して、プレート全体に均一に細胞を分配するために注意しながら、皿に​​MESC懸濁液の10ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターに皿を置きます。
   3. 3日目：メディアの変化
      1. インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。コロニーは光沢を失い、平らに現れ始める必要があります。
      2. 皿から培地を除去し、穏やかに新鮮なOP9 10mlのを追加メディア。
      3. インキュベーターに共培養皿を返します。視覚的にコロニーの80〜90％は、視覚的に中胚葉様の形態を表示する〜まで行われるべきではない次の継代（5日目）にOP9フィーダー単層製剤のタイミングを通知するために、毎日の中胚葉様コロニー形成を監視します。 5日目の細胞の転写工程の最大延期は2日です。
   4. 5日目：めっき前とトリプシン仲介通過。
      注：最適なコンフルエントOP9細胞を事前に10cmの皿の十分な数を用意してください。共培養は、視覚的にステップ3.3.3で説明されている機能が表示された場合にのみ次のステップに進みます（これも代表的な結果を参照してください）​​。
      1. 共培養皿からメディアを取り出します。洗浄するために4ミリリットルのPBSを追加します。 PBSを旋回し、削除します。 0.25％トリプシンの4ミリリットルを加え、約5分間インキュベーター内で皿を置きます。
      2. まで、過剰な気泡を導入しないように注意しながら、激しいピペッティングによりトリプシン処理した細胞層を乱す均質で、主に単一細胞懸濁液が達成される。
      3. 完全なOP9メディアの4ミリリットルを加え、ピペッティングにより混和する。 OP9細胞はシャーレに付着させ、30分間インキュベーター内で新しい空の10cmディッシュ、所定の位置に細胞を移す。この「プレめっき」のステップは、共培養の次のステップに移し、OP9細胞の数を減少させる。
      4. 40μmのセルストレーナーで50ml遠心管を準備します。
      5. 事前メッキディッシュから非接着細胞を収集し、チューブにセルストレーナーを介してそれらを渡します。 PBSを6ミリリットルで軽く、皿を洗って、同じストレーナーに通し、背後に付着したOP9細胞を残す。
      6. 4℃で400×gで 5分間で遠心細胞。上清を除去し、完全なOP9培地3mlにペレット化した細胞を懸濁します。細胞を数える。
      7. 最適コンフルエントOP9細胞との10cmプレートから培地を除去。
      8. 各分析時点について、OP9モノに5×10 ⁵細胞を播種10ミリリットル最終容量層。
      9. 5 / mlのヒト組換え体Flt-3Lを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
   5. 8日目：造血前駆細胞（HPC）のコレクション
      注：これらはこのステップの時間が〜80％コンフルエントになるように、OP9またはOP9-DL1細胞単層が予め6ウェルプレートの十分な数を用意してください。
      1. 40μmのストレーナーで50ml遠心管を準備します。
      2. インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。のHPCのシャイニークラスタは緩くOP9単層に接続する必要があります。ピペットでOP9単層と皿上の既存のメディアを洗う（ただし、過度に崩壊されていない）により、可能な限りこれらの細胞の多くを収集します。発泡しないようにするには、常にこのHPC収集/洗浄工程の間にピペットの先端でメディアの少なくとも1ミリリットルのままにしておきます。
      3. チューブに40μmのストレーナーを通して細胞を渡します。もし、すべてのHPCを同一プレートに8ミリリットルのPBSを追加し、顕微鏡下で確認してください、私たち再収集。 （必要ならば）より多くの強力な洗浄をPB​​Sで洗浄/回収ステップを繰り返します。すでに同じプレートからの細胞を含むチューブに細胞株。
      4. 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。
      5. 5 ngのOP9培地の3ミリリットルのマスターミックスを（プレートあたり5日目に播種）の準備/ mlの体Flt-3Lおよび1ng / mlのIL-7。
      6. 体Flt-3L + IL-7マスターミックス（処理された各10cmディッシュ用3ml）でOP9培地で上清と再懸濁ペレットを削除します。 OP9細胞を6ウェルプレートの1ウェルに各プレートから採取した細胞を転送します。
         1. 単球に向けて細胞を駆動するために、B細胞または赤血球系統は、OP9細胞上に回収した細胞を播種する。 T細胞を誘導するために、OP9-DL1細胞単層上に細胞を播種する。
      7. インキュベーターに6ウェルプレートを置きます。
   6. 10日目：メディアの変化
      1. 各個別MESCクローンフィーダーセル型COMBINA用の15ミリリットルの遠心管を準備する共培養中のる。
      2. 体Flt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアのマスターミックスを調製する。各ウェルについて3ミリリットルを準備します。
      3. 穏やかに同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから培地を組み合わせる6ウェルプレートの各ウェルから培地を収集する。
      4. 各ウェルに（3.6.2を参照）OP9メディアマスターミックスの2ミリリットルを追加します。
      5. 遠心し、4℃で5分間400×gで収集したメディア。ウェルあたりOP9メディアマスターミックス1ml中各ペレット（可視の場合、非常に小さい）（3.6.2を参照）へのステップ3.6.3に集めて上清を除去し、懸濁します。
      6. よく戻って各への細胞の1ミリリットルを配布メディアは、もともと3ミリリットルを各ウェルにボリュームを持っ収集された。インキュベーターに皿を返します。
   7. 12日目：いいえトリプシン通路
      注：これはsの彼らは最適の時間でコンフルエントされるように、事前にOP9またはOP9-DL1細胞と6ウェルディッシュの十分な数を用意TEP。 12日目には、赤血球、単球、および初期段階のT細胞の開発の分析、フローサイトメトリーに最適です。
      1. マスターミックスのFlt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアの（共培養で継続され、各ウェルのために3ミリリットル）を準備します。
      2. 40μmのストレーナー（共培養中の各ESCクローンフィーダー細胞型の組み合わせごとに1つ）で50mlの遠心管を準備します。
      3. 激しくウェル中に（単層を含む）のすべてのセルを分解するために、各ウェル内の既存のメディアをピペット。単一細胞懸濁液に似た状態が達成されるまで、力強いピペット操作を続行します。
      4. チューブにストレーナーを通して採取した細胞を渡します。残りのすべての細胞を洗浄し、収集するために各ウェルに3mlのPBSを追加します。同じストレーナーを通して細胞を渡します。同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから細胞を結合します。
      5. 使用セルストレーナーを破棄し、1ウェルにアリコート相当を削除（〜6ミリリットル）、任意のためのフローサイトメトリー（または他の）は、その日に行わなければ分析する。使用前に氷の上にこれらのアリコートに保管してください。
      6. 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。上清を取り除きます。ウェル当たりマスターミックス3mlに50mlの遠心分離管からのペレットを再懸濁し、再播種する。適切なフィーダー細胞型への各細胞懸濁液ウェルあたり3ミリリットルを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
   8. 14日目：メディアの変化
      1. セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
   9. 16日目：いいえトリプシン通路
      注：このステップのために、事前に最適なコンフルエントOP9またはOP9-DL1細胞の6ウェル皿を準備します。
      注：16日目は​​、Bリンパ球および中段T細胞の解析、フローサイトメトリーに最適です。
      1. 3.7節で説明されている手順に従ってください。
   10. 18日目：メディアの変化
       1. セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
   11. 20日目：いいえトリプシン通路
       注：20日目私フローサイトメトリーのための理想的なのは、T細胞の開発後期半ばの分析。
       1. 3.7節で説明されている手順に従ってください。必要に応じて、培地交換なしトリプシンを交互過去20日目分化する細胞を運ぶリンパ球の拡大率を毎日モニターしながら、日おき通路。

結果

LIFの存在下で、MEF上で増殖させた場合、たmESCは、未分化状態に維持することができる。理想的な条件下では、それらは位相差顕微鏡（ 図1）に光沢のあるハローに囲まれた細胞のコンパクトなコロニーとして見える。これらの培養物を毎日監視する必要があります。細胞のコンフルエンスに応じて、メディアを変更することができ、または細胞が分割することができる。隣接MESC...

ディスカッション

OP9-DL1共培養系幹細胞からの血液細胞型の発達中のさまざまな遺伝子産物の役割を研究するために利用されている^。8,12,13また、遺伝子調節DNAの機能を研究するための有効なモデルを証明して細胞分化の間に^。9,14全体のマウスモデルの代替としてこの方法を使用すると、造血における多くの基本的な質問に対応した実験の時間とコストでかなりの節約をもたらすことができる?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab