の高分解能電子顕微鏡<em&gt;ヘリコバクター·ピロリ</em鉄の可用性の変化する条件で生産&gt; CAG IV型分泌系線毛

要約

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

要約

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population^1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide³. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA^4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells^5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks^5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”⁵. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface^9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

概要

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer¹. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet¹¹. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression¹². Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis¹³. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease¹⁴. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion¹⁵. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur^16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer¹. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease^11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains¹⁴. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle¹⁰.

プロトコル

1. H.ヒトの胃上皮細胞と鉄可用性と共培養の様々な条件でピロリ菌の成長

1. H.を選択これらの研究のためのピロリ菌株のPMSS1それが無傷のCAG病原性島を有しており、機能しているIV型分泌系を表現しているため。また、ネガティブコントロールとして同質遺伝子ケージ変異体（PMSSIΔCAGE）を利用する。 5％CO ₂存在下、37℃で24時間、5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したTSAプレート上で細菌を成長させる。
   注：試薬を準備し、材料および装置の表で概説したような材料を組み立てる。各試薬の最終的な濃度は、括弧内に記載されています。
2. 滅菌綿棒を用いてプレートからの細菌をこすりや部品から製造された改質ブルセラブロス中に接種し（材料および機器の表を参照）およびコレステロールを補った。 37で一晩培養液をインキュベート毎分（rpm）200回転で振とうしながら、5％CO ₂を補充した室内空気中のC°。
   NOTE：コレステロール起因血清が複雑であるという事実のために、ウシ胎児血清の代わりに使用されている。結果のばらつきの原因となるようなヘムなどの栄養素の鉄の多数の供給源を含む。
3. 細菌培養の日に、12ウェルプレート（ウェル当たり約1×10 ⁵細胞）でポリ-D-リシン処理したカバースリップ上にAGSヒト胃上皮細胞（ATCC CRL-1739）をシードする。
4. 次の日、100μMのFeCl _3を 、200μMのジピリジルの（合成鉄キレート剤）、または200μMのジピリジルプラス250μMのFeCl _3を補充しただけでは修正されたブルセラブロス中0.3のOD600以降に細菌培養を希釈。 200rpmで振盪しながら、5％CO ₂を補充した室内空気中、37℃で4時間、これらの培養物をインキュベートする。
5. 千×gで遠心した細菌は、細胞を収集し、私を再懸濁する前に、上清を削除するにはnは新鮮修正ブルセラブロス等量のは、コレステロールを補った。文化の尺度OD600（×10 OD600 = 1.0 = 5.5 ⁸細胞/ ml）及び20の感染多重度（MOI）の上皮細胞への細菌を追加：1。細菌細胞の生存率を評価するために、血液寒天プレート上に連続希釈し、プレート細菌細胞を実行する。
6. Hをインキュベート走査電子顕微鏡（SEM）試料調製を行う前に、静的条件下で、5％CO ₂の存在下、37℃で4時間ピロリおよびAGSヒト胃上皮細胞の共培養。

2. SEM Hを可視化するためにサンプル調製ピロリ CAG-T4SS線毛

1. Hを削除するピロリ菌とインキュベーターとデカント培養上清からのAGS共培養（IL-8 ELISAのために保存）。 0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で穏やかに3回洗浄する。 2.0％パラホルムアルデヒド溶液中で、室温で2.5〜4時間のサンプルを修正％グルタルアルデヒド、および0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液。一次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。
2. つの連続10分間の固定ステップで0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の0.1％四酸化オスミウムを用いた二次固定を行う。二次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。
3. 一次および二次固定した後、 表1の通りのエタノール濃度を増加させて、順次洗浄することにより試料を脱水する。
4. エタノール脱水後、液体二酸化炭素の3つの連続回の洗浄を行う。 1073 PSIの31.1ºCの温度及び圧力で臨界点乾燥機を用いて、臨界点でのドライサンプル。
5. マウントは、アルミニウムのSEM試料スタブ上にカバースリップとの適切な接地を実現し、SEM画像中に充電を回避するために、サンプルエッジでコロイド銀の細い線を描く。
6. コー​​トサンプルを5nmと試料の二次電子信号とエッジ効果を高めるためにスパッタコート機を用いて金 - パラジウム。

高解像度のSEM分析3.イメージングパラメータ

1. 電界放射銃走査電子顕微鏡（FEG-SEM）を持つビュー·サンプル。
2. 5〜10ミリメートルの作動距離で高真空モードでの画像。
3. 5 kVの加速電圧に設定してください。
4. 2-2.5にスポットサイズを設定します。
5. 宿主 - 病原体インターフェースのより良いビューを達成するために、15〜25度の間の試料を傾けて。
6. 宿主 - 病原体相互作用のこれらの領域は線毛形成細菌のために濃縮されているように、高倍率の視聴のための上皮細胞のエッジに付着細菌を画像化する優先順位をつける。

Piliの数量化を評価するために4.統計分析

1. H.を分析線毛/セルならびにpiliated脱pheを示す細胞のパーセント数を定量化するためにImageJソフトウェアを使用してピロリ CAG-T4SS線毛下記の指示に従ってNOTYPE。
2. ImageJソフトウェアで開く顕微鏡写真ファイル。均一な幅（10-13 nm）を、長さ（60〜150 nm）を用いて、細菌細胞と宿主細胞との間に形成された構造として線毛を識別する。
   注：線毛構造が主要なATPアーゼ大国IV型分泌線毛アセンブリをコードする遺伝子における不活性化を抱くようなΔ ケージ変異株として同質遺伝子株は、上のWTの細菌株上に存在するが、存在しない。
3. 直線ツールで線を引くと、次に「分析」タブをクリックすることにより、測定ツールを校正。ドロップダウンメニューから「セットスケール」を選択し、「既知の距離」というラベルの付いたボックスに倍率バーの値を入力し、適切な設定（ナノメートル）の長さの単位を設定します。 「OK」をクリックします。
4. 線毛の長さや幅を上に描画するために直線ツールを使用して、CAG-T4SS線毛を測定し、各線毛を測定するためには、 "Ctrl-M」を押してください。測定された値を持つダイアログボックスを守ってください。これらの値を記録したりコピーし、表計算プログラムに貼り付けます。
5. 長さを使用し、幅のパラメータは、以前にCAG-T4SSのプロファイルに適合しない^24、無視機能を設立しました。その後、10〜13 nmの幅と60〜150 nmの長さのカットオフ内にある値に基づいて線毛の数を定量化する。
6. を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して両側スチューデントt検定によって統計的に線毛の定量分析を行う。

5.オプション：IL-8分泌の評価は、線毛の生産と相関する

1. ステップ2.1から上清を用い、キットを製造業者の指示（材料および装置の表を参照）ごとに、IL-8のELISAを行う。
2. IL-8は、宿主細胞によって分泌を分析し、培地単独中で成長WT PMSS1に対するパーセントのIL-8誘導を計算する。これを、GraphPad Prismを使用して、両側スチューデントt検定を用いて統計分析を実行するftware。

結果

本稿では、鉄利用能を変化させる条件はH.を調節する能力を有することが実証されているホスト病原体の界面でのピロリ菌 CAG-T4SS線毛生合成。 、H。単独の培地で培養した場合ピロリ菌は 3線毛/セルの平均を形成している。ときにH.ピロリ菌は、鉄で栽培されて枯渇細菌の増殖（ 図1）サブ阻害性である（合成キレート剤ジピリジルを使用）の条件...

ディスカッション

鉄は、細菌性病原体を含む人生のほとんどの形態、必須の微量栄養素​​である。侵入微生物の生存を制限するための努力では、脊椎動物のホストは「栄養免疫^」18として知られるプロセスで栄養鉄を隔離する。これに応答して、細菌性病原体は、その周囲を感知し、そのような鉄獲得システム、毒素および毒素分泌機構^19,20などの病原性機能の精緻化を調節するためにグロ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)	Sigma	70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)	Sigma	70174
Yeast extract (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Sodium chloride (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	16220
Sodium cacodylate (0.05 M)	Electron Microscopy Sciences	12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	19150
Ethanol (absolute)	Sigma	E7023
Colloidal silver paint	Electron Microscopy Sciences	12630
SEM sample stubs	Electron Microscopy Sciences	75220
Coverslips	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit	R&D Systems	D8000C