当然の雌ラットをサイクリングで馴化恐怖の消滅を研究するためのプロトコル

要約

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

要約

条件付け恐怖の絶滅は広範囲に男性のげっ歯類で研究されてきた。最近では、特定の行動のタスクとレスポンス行動のための神経機構は、女性と男性では異なっていることを示す研究が増えてきた。調査研究にメスを使用すると、それらの発情周期中の性腺ホルモンの変化の挑戦を表すことができます。このプロトコルは、雌ラットの恐怖絶滅メモリの統合におけるエストロゲンの役割を調査するのに有用である十分に確立された手順を説明します。発情周期と外因性エストロゲンの投与の前に消光訓練の位相が2​​4時間後に吸光リコールに影響を与えることができる。ここで説明発情相同定のための膣拭き取り技術は自然に性腺ホルモンをサイクリングの検査と操作を補助する。この基本的な齧歯動物モデルの使用は、中恐怖消去メモリを調節することができるエストロゲンメカニズムを描写することができるメス。

概要

固有性差は、ヒトとげっ歯類の両方で様々な認知行動や学習パラダイム間で観察される。例えば、男性は、良好な空間能力^1-3を有し、一方、女性は、一般的に、より強力な口頭および詳細指向能力を有することが報告されている。これらの性差は、性腺ホルモンの影響に一部起因することができる。高いエストラジオールレベルは、女性がより良いである、タスクのパフォーマンスを向上させることが、男性は一般的にうまく^4-6を行うタスクのパフォーマンスを悪化させる。この証拠は説得力があるが、完全にヒトでの研究で、実験環境を制御するために、限られた能力は、行動上のこれらの効果はホルモンに特異的に起因することができた場合、それが困難に決定することができる。動物実験は、対照的に、完全に制御された状況を可能にする。

恐怖消去の基本的な神経機構が同定されており、よく男性で研究されているが、かどうかは不明であるこれらのシステムは、女性またはそれらがどのように発情周期にわたって変更は同じである。恐怖条件付けと絶滅広く不安障害に関連する研究を行うために、げっ歯類およびヒトにおける行動パラダイムを使用している。女性は、不安障害のリスクが高いだけでなく、より高い症状の持続期間および重症度^7~13を有すること^を考えれば、これらの研究において、女性を含めることが重要である。本研究では、女性の過少は、性ホルモンの行動への影響のための発情期の監視と会計の課題に起因すると考えられる。しばしば報告されていない行くか、または彼らの研究のための方法に記載されていないこの点に関して遭遇問題にメスを調べてやる研究所。

げっ歯類で証拠を新興恐怖消去における性差は生殖腺ホルモン^14-18で変調されていることを示唆している。恐怖条件付けでは、動物は特定の刺激を恐れるように訓練されている。の未強化の発表数の後刺激は、動物はキュー、絶滅と呼ばれるプロセスを恐れることはない学ぶ。どれだけ動物を学習し、絶滅のトレーニングの後にいくつかの時間を与えられた吸光リコールテスト中に観察することができ、このタスクを学習するのメモリを統合します。絶滅のリコール時の少ない恐怖式が良い絶滅メモリの統合を示しています。私たちの研究室からの最近の知見は、エストロゲンは恐怖消去メモリの統合を調節し、絶滅のリコールを改善できることを示唆している。具体的には、発情前期に消滅している雌ラットは、発情周期の位相はその間エストロゲンレベルのピーク、絶滅メモリの展示強化保持を循環させる。対照的に、前または直後の吸光トレーニング^15,16の後、外因性エストラジオールの投与によって改善することができ、低エストロゲン発情後期相表示比較的乏しい吸光リコールに消滅する雌。絶滅メモリの統合の神経機構（税込雌の生殖腺ホルモンの役割を）udingすることは明らかではない。

実験動物では、ホルモンの役割は、去勢および卵巣摘出などの侵襲的な外科的除去の手順を使用して調べることができる。手術からの回復に続いて、性腺ホルモンは、多くの場合、外因的行動のタスク¹⁹の実行中に操作されます。このアプローチは、性ホルモンについての重要な情報を提供し、それが^20〜23（タイミングと投与量の面で）性腺ホルモンのよく制御された操作を可能にしているため便利ですしている。しかし、このアプローチは、発情周期にわたって生じる、天然に存在する変動の影響を評価せず、また、彼らは、それによってヒトの研究に並進可能性を制限する、「正常な」動物を表しています。これは、特定の発情周期の位相、及びサイクル内のエストロゲン受容体発現の変化で女性ホルモンのレベルがピークと衰退することを十分に文書化された、と卵巣摘出²⁴の後。したがって、確実に高および低エストロゲン状態はそれらの寿命を通して、女性に与えることができるという効果を研究するために無傷の生殖腺とメスの研究を実施し、実験計画を改善する必要がある。

このプロトコルは、恐怖消去に関与神経生物学的システムでのエストロゲンの影響に焦点を当てています。 1）慎重に、発情周期を監視2）全身投与のためのエストラジオールの効果的な用量を準備し、3）恐怖条件、絶滅が含ま行動パラダイムに従っており、自然にサイクリング雌ラットをでリコール：それはどのように説明しています。このプロトコルは、より良好な消光挙動恐怖条件付けで観察された性差を理解するために研究を支援するために他の薬理学的操作および細胞および分子ツールを使用して修飾することができる。以下の手順は、私たちの研究室内で利用するものである、と私はこれらの手順の多くの変形が存在することに注意してくださいnの文学。

プロトコル

注：このプロトコルですべての手順は、マサチューセッツ総合病院のための施設内動物管理使用委員会（IACUC）となって研究動物管理小委員会によって承認され、健康のガイドラインの国立研究所に準拠しているされています。

1.動物住宅及び取扱い手順

1. 木材チップの寝具3-4インチのプラスチックビンのグループで到着すると、家の大人のSprague Dawley雌ラット（200〜225グラムの重さ）、年齢の約8〜10週間。固形飼料および水に自由摂取へのアクセスの食事と12時間の明/暗サイクルでそれらを維持する。 1週間の最低住宅事情と動物施設に順応するために、ラットのままにしておきます。
   注：この原稿のすべての手順は、光サイクル中に行われている。
2. この順応期間の後、2〜3日間、5分ごとに、すべての動物を扱う。適切に（胴体によってませ尾でサポートされている）一度にラット1を拾う、確実に固定して保持し、この時間の間に、それらをペット。激しく揺れる、またはより長い期間のために心配して、ストレスをより多く表示された動物を扱う。このプロトコルでは、次の手順に影響を与える可能性があり、ストレスを扱う最小化するためにこれを行います。
   注記：動物の取り扱い時の日数および量は、異なる研究室間で変化させることができる。しかし、これらは、同じラボ内での実験の間で一貫している必要があります。

膣スワブスミアと染色手順：発情周期を監視する2.

1. 0.9％食塩水（塩化ナトリウムを蒸留水に溶解）を作る。この溶液中で綿棒を湿らせます。不十分なサンプル収集または細胞の喪失につながる可能性が過飽和を回避するためにペーパータオルを使用して先端ブロット。上向きに離れて膣口から尾を持ち、静かに緩い膣の細胞を捕捉するために、壁の周りの膣管とロール状に綿棒を挿入します。
2. 動物はベッドに排尿した場合尿汚染が相同定のために、それが困難になりますようにトンの先端は、新しいものと交換してください。ストレスへの暴露が発情周期を混乱されるため、この手順の間に動物に苦痛を与えないよう十分に注意してください。拭き取りすると、偽妊娠を誘導することができる子宮頸部への余分な刺激を最小にする深すぎないが、迅速挿抜を実現することを目指しています。
   注：偽妊娠、 すなわち典型的には約12日間続く ​​非環発情周期、発情²⁵の連続した日として同定することができる。
3. 慎重にアプリケータ先端部を除去し、予め標識顕微鏡スライド上にそれをロール。スライド上あまりにも多くの流体としてあまりにもハードダウン押すとドライ一度相同定を困難にすることができないようにしてください。
   注：これは個人の好みに応じて行うことができるが、一つのスライドは、各動物の複数の日を含むことができる。
4. スライド上のサンプルの転送を確認してください。断つためのサンプルを収集1スライド上のAl日間連続、より追跡できるようにし、毎日の発情期の変更を識別します。
   注：可能な場合はサンプルを収集する人々は、すべての動物のために同じままなら、それはまた、理想的です。
5. スライドが乾燥していると、位相識別のための染色プロトコルを開始する。染色キット（材料の表を参照）を使用し、固定液（水色）のスライドを10回浸す、（ピンク）染色液で10倍、と対比溶液中の5倍（紫）。流水で軽くスライドをすすぐ。顕微鏡下で表示する前にスライドを完全に空気乾燥してみましょう。
   NOTE：発情（E）、発情（M）、発情間期（D）、および発情前期^（P）26：一般的に4~5日長い発情周期を（この順序で）で構成されている。発情期は、青、角化細胞によって特徴付けられる白血球による発情及び角化および有核細胞の組み合わせ、それらは非常に疎である以外は、発情間期細胞型の存在下での発情と同様であり、紫色に染色された凝集によって発情さの有核細胞（ 図1）。膣スミア診のために等しく有効である上述のものに加えて、種々の染色手順は、がある。
6. 実験前に正確に位相を監視するために、少なくとも2つの完全なサイクル（〜8〜10日）のためにサンプルを収集する。サンプルが取られる時間帯と一致している。全体と実験の終了まで毎日の膣スメアサンプルを収集します。

3.事前暴露

1. 実験の開始前に、チャンバーは動物がどんな行動試験の前にコンテキスト（空調室）に順応できるように調節する動物​​を事前に公開します。
   1. すべての実験の前に3日間、一日あたり20〜30分に家のライトが付いている（音減衰ボックスにあります）空調室にメスを事前に公開します。彼らは研究のための彼らの室と事前にさらされているボックスを割り当てます。完全に洗浄トン彼らは行動と発情周期に影響を与えることができるので、臭いを除去するためのセッションと動物の間、彼は箱（壁やトレー）。

4. 1日目：馴化/恐怖条件付け

1. 動物は彼らの発情周期の発情期にあることが確認された後、3日間の実験の馴化/コンディショニングフェーズを開始。
   1. 実験前の各日に刺激（CS）のプレゼンテーションを条件付け最初のトーンに凍結の前トーンベースライン対策を行ってください。 CS発症前の最初のCS-単独の裁判の開始時に刺激不在の時間間隔の間に（100を掛けた裁判の期間によって不動費やし秒で除して算出、）％の凍結のスコアを取得することによってこれを行います。
      注：これらの対策は、馴化、コンディショニング、消滅、およびリコール時とベースライン凍結レベルを評価し、比較することができる。
   2. 発情後期フェーズの間に絶滅の研修を実施する、発情期の彼らの最後の日に、ラットを条件付け。綿棒と識別する発情期（ステップ2）実験プロトコル（空調/絶滅/リコール）を開始する前に、毎日。発情期は1日より長く続くことのような動物がトレーニングを開始する準備ができたら、使用サイクル履歴が決定するために、位相の長さを予測する。
2. 空調室では、電気刺激発生器に足ショックグリッドの床に接続します。無条件刺激（US）として0.5〜0.6ミリアンペアの刺激レベルを使用します。条件刺激（CS）として4 kHzの、80デシベルの音を使用してください。
   注：これらのパラメータは、実験室間で異なることができ、最適なコンディショニングのために修飾することができる。
   1. 凍結解析プログラムは、視覚的な手がかりを（一時的ではなく）が必要な場合は、トーンにLED光を共活性化する。ビデオフレーム内の、オペラントチャンバーの外側に光を置きます。各試験の開始時に、LEDライトを活性化し、それが目の終わりまで照らされ続けるEトライアル。
      注：この光は動物では表示されませんとだけ開始及び（凍結挙動を測定するために使用される）を記録したビデオファイル内の試験終了のためのマーカーとして役立つ。
3. 慣れの5 CS-単独の試験のための空調室に動物を置きます。すぐに慣れセッション以下、恐怖条件付けの7ペアCS-USの試験を行う。 CS音が30秒間持続し、0.5秒、米国のショックにcoterminatesていることを確認してください。 3分を平均可変試行間間隔ですべてのセッション（慣れ、エアコン、絶滅、およびリコール）で試験を実行します。
4. コンディショニングセッションの最後に、次の日まで、ホームケージに及び動物施設に動物を返す。

5. 2日目：エストラジオール準備

1. このプロトコルの1日目を受けたすべての動物のための発情期を綿棒識別する。エストラジオールを準備します（またE2、、17β-エストラジオール、またはとして知られているビヒクルとしてゴマ油または0.9％生理食塩水を用いて15μgの/ kgの用量の皮下注射のためのベータ - エストラジオール）。
2. 注射の準備をそれらがこのプロトコルの1日目に調整したときに測定し、記録した全ての動物の体重を使用するエストラジオールの量を算出する。
3. ラットあたりエストラジオール（ すなわち 0.2ミリリットル）の投与量を標準化するために計算を行う。エストラジオールは、その水不溶性に溶解させることは困難であり、少量のために大量の溶媒を必要とするので、溶解するまで、弱火ゴマ油中のエストラジオールを混合することにより原液を調製。次いで、溶液を汚染物質を除去するために0.22μmのフィルターを通過させることができる。例えば、動物当たり0.2ミリリットル注入量では15μg/ kgの用量を達成するために、ごま油の合計に必要な体積に3000μgのエストラジオール/ 1ミリリットルゴマ油原液の計算されたボリュームを追加する。
   注：あるいは、エストロゲンTHAの他の形態を使用する tは、水溶性および溶解が容易である。

6. 2日目：エストラジオール管理/絶滅トレーニング

1. エストラジオールを皮下投与する。穏やかなピンチに首、肩甲骨の間でたるんだ皮膚を持ち上げ、皮膚折り目によって形成される三角形に注射針を挿入します。
2. エストラジオールの皮下注射後30分、再びコンディショニング室で動物を配置し、絶滅のトレーニングを始める。この絶滅セッションでは、3分の平均を可変試行間間隔で発表され、30秒、4 kHzの、80デシベルの音、からなる各試行で、20 CS-単独の試験を行う。
   注：エストラジオール前絶滅の訓練にか、すぐに絶滅後に投与されたときにリコールに対するエストラジオールの効果が発生します。効果は4時間後に絶滅を観察していないので、それはトレーニングセッション¹⁵の開始または終了に時間的に近い注入することをお勧めします。

ル "> 7 3日目：絶滅リコール

1. 絶滅のトレーニング後24時間、1日目とこのプロトコルの2を完了した動物が綿棒。
2. （1日目と2と同じ）、割り当てられた空調室に動物を置きます。ステップ6.2で説明したように絶滅の訓練のために投与20試行に似て試行間間隔を持つ唯一の3.80デシベルCS-単独の臨床試験で構成されて3 CS-単独の臨床試験（絶滅のリコールの3件の試験）を、提示することによって、絶滅リコールセッションを開始します。
3. リコールセッションが完了すると、ホームケージに動物を返す。

8.データ解析

1. 映像を通じて行動データを取得し、コンピュータソフトウェアを使用して分析する。
   注：凍結スコアは手動でも各試行のCSプレゼンテーション中に凍結発作のタイミングによる薬物治療に盲目である実験者によってカウントすることができ、音の間に凍結した時間の割合として表さ。凍結がある30秒CS-USの試験中の呼吸を除いて、運動の完全な欠如によって定義される。 100を掛けた30秒（トライアルの期間）によって（不動）を凍結費やし秒で割って％の凍結を計算します。

結果

この恐怖消リコールプロトコルでは、パーセント凍結は恐怖の指標として測定した。よく消滅と絶滅の訓練の記憶を保持した動物は、絶滅のリコール時の行動試験の最終日に、低恐怖を示した。オスとメスのラットは大幅にエアコン、絶滅の間、条件付け恐怖の表情が異なり、相（ 図2）覚えていません。動物は高および低エストロゲン発情位相群として別々に分析されている場...

ディスカッション

恐怖の絶滅は、様々な操作の下で特定され、評価され、馴化恐怖消去を仲介する神経機構と雄ラットで広く研究されてきた。比較的少数の研究は、雌ラットや恐怖消去における性腺ホルモンの役割を検討した。特に恐怖消去に対するエストロゲンの効果を研究するために、自然に循環する雌ラットは、3日間の行動パラダイムに供される。この手順では、馴化/エアコン、絶滅、絶滅リコール?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge