生理学ラボデモンストレーション：ラットにおける糸球体濾過率

要約

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

要約

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

概要

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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プロトコル

任意の動物手順、制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）の前には、プロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、ミシガン州立大学IACUCによって承認されました。

FITC-イヌリン溶液の1前のラボの準備

1. 全てのイヌリンが溶解するまでゆっくりと加温20〜70℃の生理食塩水のミリリットルとは、FITC-イヌリン（5 mg / mlのFITC-イヌリン）を100mgを加えて混ぜます。
2. 室温に冷却液と（基本的に、アガロースゲル電気泳動によりフリー、低エンドトキシン、≥98％純度グロブリン、40 mg / mlのBSA、凍結乾燥粉末）、ウシ血清アルブミン800mgのを追加します。
3. 濾紙（グレード1）とイヌリンBSA溶液をフィルタリングします。シリンジチップフィルター（0.2μm）で、20 mlシリンジで濾過した溶液を置き、光から保護するためにホイルでカバーしています。

2.麻酔と手術

1. 麻酔を誘導するために、5％のイソフルランで満たされた導入室にラットを置きます。レコードBODY重量（250〜350グラム）と、実験を通して37℃の体温を維持するように設計された加熱された外科用プラットフォーム上にラットを置きます。ゆっくり足の上に実験用テープでプラットフォームにラットを固定します。 0.8〜1.0リットル/分の空気流量で医療グレード100％のO ₂を1〜2％イソフルランで麻酔を維持します。
2. 血圧および心拍数のモニタリング、及び血液サンプリングのために大腿動脈にカテーテルテーパー（血管内先端OD、2.7F）を挿入します。
3. イヌリン注入のための大腿静脈にカテーテル（PE-50）を挿入します。 5-O編み絹縫合糸⁶と周囲の組織にカテーテルを固定します。
4. ひずみゲージ圧力変換器に動脈カテーテルを取り付けます。リアルタイムでコンピュータ画面上のデータ取得ソフトウェア、ディスプレイを使用して記録する血圧と心拍数。この技術は、映像⁶に詳細に示されています。
5. 恥骨上切開により膀胱を公開します。小さなをカット膀胱の先端に穴や熱でカニューレ（PE-190）を挿入するには、尿採取のために、膀胱の内側に先端をフレア。巾着縫合で膀胱にカニューレを固定します。

3.尿や血液コレクション

1. 1ミリリットル/体重（300グラムの重さのラットについて3ミリリットル/時）の100グラムあたりの時間の流速が設定されたシリンジポンプにFITC-イヌリンの注射器を置きます。大腿静脈カテーテルに注射器を取り付けます。イヌリンの注入を開始し、1〜2時間の平衡期間を可能にします。光から保護するために箔で覆われた注射器を保管してください。
2. 尿流量が安定しており、10分の期間、予め秤量した回収バイアル中の尿サンプルを採取することにより、試料分析（20μL/分）のために適切であるかどうかを確認します。デジタルスケールで重量測定により尿量を決定します。 10分の回収期間のための適切な尿量は、0.2 mlです。二つの連続コレクションが20μL/ Mの尿流量を示すまでの尿サンプルを収集し続けますで以上。
3. プレドラッグサンプル
   1. 20分の期間中に尿サンプルを採取します。尿収集期間の中間点において動脈カテーテルから血液サンプル（0.5ml）に収集します。 1 Uのヘパリンを含むコレクションバイアルに血液サンプルを収集する前に生理食塩水を完全に透明に動脈カテーテルに注意してください。動脈血の0.5ミリリットルの収集を容易にするために、ボリュームマーキングコレクションバイアルを使用します。
   2. 血液（約0.1ミリリットル）のカテーテルをクリアするためにヘパリン生理食塩水（20 U / ml）で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルの長さは、洗い流すために必要なヘパリン - 生理食塩水の量​​を制限することが可能な限り短くすべきです。
      注：希釈された血液サンプルはGFRおよびNaとKの分数排泄の不正確な計算を生成します
   3. 10分待ってから、第2のプリ薬物の尿と血液サンプルの収集を繰り返します。
4. 2つの事前薬物サンプルの収集に続いて、利尿DRUの管理G、フロセミド（10mg / kgの）、動脈カテーテルを介し。薬物のカテーテルをクリアするためにヘパリン化生理食塩水で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルを介して空気を注入しないように注意してください。フロセミド注射の時間を記録します。
5. 尿収集期間の中間点で下3時間点の各々で、10分間の収集期間中に尿サンプルを採取し、血液試料（0.5mL）を：ポスト薬剤サンプル。
   1. 後薬物サンプル1について - フロセミド後5分を収集します。
   2. 後薬物のサンプル2について - フロセミド後10分を集めます。
   3. 後薬物サンプル3について - フロセミド後に15分を集めます。
6. 全てのサンプルが収集された後、開胸し、心臓を除去することによって機関の手順に従ってラット安楽死させます。両方の腎臓を削除します。逆カプセル化（周囲の膜を除去）し、過剰の血液を除去するために腎臓をブロット。腎臓を計量。

4。試料分析

1. デジタルスケールで重量測定により、すべての尿サンプル量を測定し、記録の重み。
2. テーブルトップ遠心機（1,800 XG）で遠心分離し、全血サンプルは、血漿を分離しました。小さなラベル付きバイアルに血漿サンプルを転送します。
3. ナトリウム/カリウムアナライザーで尿および血漿試料中のNa、Kの濃度を分析します。
4. 血漿および尿中のFITC-イヌリンの測定
   1. HEPES緩衝液（500mMの、pH7.4）で、ポスト薬物尿（1:10）（400：1：200〜1）から予め薬物尿を希釈します。
   2. 96ウェルプレート（ウェルごとに1つのサンプル）にHEPES緩衝液の標準またはサンプルを60μlの40μlを添加して、アルミホイルで覆いながら10分間混合することができます。
   3. の濃度についてのFITC-イヌリンの標準曲線を生成6.25、12.5、25、50、100、200、400 / mlの（ 図1）。元にマイクロプレートリーダーを使用してサンプルと標準でFITC-イヌリン蛍光を決定それぞれ485および538 nmでの引用及び発光波長。
   4. 4-PARAMTERロジスティック関数の回帰分析に標準の蛍光値を取り付けます。回帰関数のパラメータは、血漿および尿サンプル（ 表1）にFITC-イヌリン濃度を計算するために使用されます。

結果5.ポスト​​ラボ分析：計算

1. 【尿量収集（ミリリットル）]÷[収集の時間（分）]：;尿流量（ml /分UV）を計算します
2. 糸球体濾過率を計算（GFR、ml /分）：尿イヌリン濃度（/ mlの）UV（ml /分）をX]÷[血漿イヌリン濃濃度（μg/ ​​ml）を]
3. 計算フィルタリングさナトリウム負荷（μモル/分）：血漿ナトリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
4. 尿中ナトリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;ナトリウム排泄率（μモル/分U _のNa V）を計算します
5. ナトリウム排泄分画（;％FE NA）を計算します：[U _のNa V（マイクロモル/分）]÷[濾過ナトリウム負荷（マイクロモル/分）]×100
6. 計算フィルタリングさカリウム負荷（μモル/分）：血漿カリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
7. 尿中カリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;カリウム排泄率（μモル/分U _K V）を計算します
8. 計算カリウムの分別排泄（FE K;％）：[U _K V（マイクロモル/分）]÷[濾過カリウムロード（マイクロモル/分）]×100

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結果

ラボのデモに使用される利尿剤は非常に迅速に薬物投与の数分以内に増加したのNa、K、その結果、腎臓、および水の排泄によってフィルタリングNaおよびKの再吸収を阻害するフロセミドました。その主要なメカニズムによって、フロセミドは、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷の最小の効果を持っている必要がありますが、尿の流れを増加し、NaおよびKの分数排泄

麻酔し...

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ディスカッション

血漿タンパク質に結合していないこと、自由に糸球体で濾過され、吸収されたことも、ネフロンに分泌されることもない：GFR測定のための適切なマーカーは、4つの基準を満たす必要があります。イヌリンはこれらの基準を満たすフルクトースポリマーです。その結果、イヌリンの腎クリアランスはGFR ^7を測定するためのゴールドスタンダードと考えられています。実証技術はイヌリ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420