一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

要約

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

要約

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

概要

^{5,8,10 - - 13,17,23}またはRNA ^7,22定期的な^3,4,7、前の核酸の自己組立作業^{1-25は、DNA 2}を含む複雑な構造の様々な成功構築につながっています²²とアルゴリズム⁵二次元格子、リボン^10,12およびチューブ^4,12,13、3次元結晶^17、多面体¹¹と有限、2Dは^7,8を整形します。 ^{21,25 - 16,18 -}特に効果的な方法は、単一の足場鎖が複雑な形状^9,14を形成するために、多くの短い補助ステープルストランドによって折り畳まれることにより足場のDNA折り紙、です。

我々は最近、一本鎖のタイル（SST）を使用して、所定の2次元形状を有する個別のナノ構造を構築するための方法を報告し、DNA折り紙²⁶に匹敵する複雑さを有する構造を示しました。このarticleは私達の初期の作品²⁶の適応であり、正確に所定の寸 ​​法（幅と長さ）および形態と洗練された有限の2次元形状に個別にアドレス指定するSSTを配置するための詳細なプロトコルを記述します。 SST方式の一つの重要な利点は、そのモジュール性です。構造体のすべてのコンポーネントのSSTアセンブリでモジュール構造単位として機能し、これらの海面水温の異なるサブセットは、異なる形状を作り出します。したがって、我々は短い、合成DNA鎖から所定の大きさや形状でナノ構造を構築するための一般的なプラットフォームを確立しました。

海面水温は、それぞれ10または11ヌクレオチド長の4つのドメイン（ 図1A）を含みます。海面水温は、その平行ヘリックスは、クロスオーバー結合によって一緒に保持されたDNA格子を作成するように結合します。各クロスオーバーは、リン酸が見やすくするための図で人為的に延伸されるドメイン2と3の間にリン酸塩です。クロスオーバーは、（離れて2ヘリカルターン（21塩基）を離間されています<強い>図1B）。複合長方形はヘリックスとヘリカル巻き数にそれらの寸法によって参照されます。たとえば、6ヘリックス幅で、8ヘリカルが長くなります長方形が8Tの長方形×6Hとして参照されます。海面水温は、取り残さ追加、またはその他の任意の形状と大きさ（ 図1C）の構造を作成するために再配置することができます。例えば、長方形のデザインは、所望の長さと半径（ 図1D）で管にロールバックすることができます。

あるいは、矩形SST格子はそれぞれ3 NMが7nmでによって、SSTの画素からなる分子キャンバスとみなすことができます。本研究では、310全長内部海面水温、左右の境界を構成する24の完全長海面水温、および上部と下部の境界を形成する28の半分の長さの海面水温の分子キャンバスを使用しています。キャンバスは、クロスオーバーによってリンクされた24の二重らせんを有し、各螺旋は28ヘリカルターン（294塩基）を含有し、したがってと呼ばれます28T矩形キャンバス×24H。 28Tキャンバス×24Hは、M13ファージの足場から作成されたDNA折り紙構造と同様の分子量を有します。

プロトコル

1. DNA配列設計

1. 28Tキャンバス×24Hを作成するために、二重らせん、各二重らせんのための上部と下部の螺旋の長さの数、およびクロスオーバーパターンを指定することで、SST-有限構造を設計するためにUNIQUIMERソフトウェア^27を使用してください。これらのパラメータを定義した後、全体的なアーキテクチャ（鎖組成および相補配列）は、プログラムにグラフで示されています。
2. 相補配列と追加要件（もしあれば）を満たすために指定された構造の鎖のための配列を生成します。 （構造体の大部分の）配列の対称性^28を最小化することにより、DNA配列を設計します。
   1. ヌクレオチド（A、C、GおよびT）1によってランダムに1を生成します。
   2. 塩基対形成の規則次の生成されたものと相補的なマッチヌクレオチド：TへのAおよびその逆; C Gへ、またその逆。
   3. 8または9ヌクレオチドを​​超えて繰り返しセグメントを使用しないでください。ときにこのような担当者反復セグメントの要件が満たされるまで、セグメントは、設計時に現れる食べ、最も最近に生成されたヌクレオチドを​​変異させます。
   4. 4つの連続した​​A、C、GまたはTの塩基を使用しないでください。
   5. 両方の場合、例えば （リンケージ点の周りに拠点をスライド避けるために（鎖のほとんどのために、それぞれ、第二十一及び第二十二のヌクレオチドとして、例えばTとGのために）一本鎖の結合点であらかじめ指定されたヌクレオチドを使用してください第二十一及び第二十二ヌクレオチドは、第二十二のヌクレオチド）が結合することになっていることを第二十一のヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合することが可能であった、Tでした。
3. ストレプトアビジン標識、チューブに長方形の変換、異なる四角形と異なるスケール全体のチューブを形成するための手動のDNA配列を変更し、SSTの露出ドメインによって引き起こされる凝集を防止します。
   1. ポリT TRAとの分子キャンバスの境界上に露出したドメインを交換してくださいCTS。
   2. ストレプトアビジン標識のために、彼らは3 'ビオチン修飾を有する抗ハンドル鎖を収容することができるようにハンドルセグメント（例えば、抗ハンドル鎖として相補的な対応品と結合することができる成分鎖に付加された余分のセグメント）を設計。
   3. チューブに長方形の変換のために、四角形から上部と下部の行を削除し、その海面水温一番上の行の2番目と一番下の行に2番目の上の対応するタイルに特有の相補性を有する新しい行を挿入します。
   4. 異なる形状の露出一本鎖ドメインの場合、10〜11ヌクレオチドの長さのポリTセグメントと交換、または露出したドメインに相補的であり、10〜11ヌクレオチド長のポリTセグメントで終了エッジプロテクターによってカバーしています。

分子キャンバスの調製

1. oligonucleotiからRNaseフリー水に溶解し、指定の配列のDNA成分鎖を得ます標準脱塩、10 nmolのスケールで合成されたオリゴヌクレオチドとV底96ウェルプレート中のデメーカー。遠心600×gで約10秒間、DNA鎖と、96ウェルプレート。
   1. ピペット2ミリリットル試験管にストランドあたり100μM（メーカー仕様）で28Tの長方形（ 図3A）×24HのためのDNA鎖と362ウェルのそれぞれから1μL。ストランドあたり200 nMの濃度で鎖混合物のストック溶液を作製するために2ミリリットル試験管に蒸留脱イオンH ₂ Oの138μlを添加します。
2. 0.2に鎖混合物の200 nMのストック溶液50μl、10×アニーリングバッファーA（50 mMトリス、pHが7.9、10mMのEDTA、250のMgCl _2）を10μl、および蒸留脱イオンH ₂ O40μlのを追加します。 mlのPCRチューブ。これは、1×アニーリング緩衝液A（5 mMトリス、pHが7.9、1 mMのEDTA、25mMのMgCl ₂を）における分子キャンバス100μlのサンプルになります。
3. samplをアニール90°Cから25°Cに冷却し、サーマルサイクラーで17時間の電子。プログラムサーマルサイクラーとしては、次のとおりです。°Cあたり5分の一定速度で61℃まで90℃からランプダウン。 C°ごとに20分の一定速度で25℃まで60℃からランプダウン。試料をサーマルサイクラーから取り出すことができるまで4℃でインキュベートします。
4. ネイティブの2％アガロースゲルを準備します。
   1. 600ミリリットルのビーカーにアガロースの2.4グラムを測定します。ビーカーに0.5×TBE緩衝液（44.5 mMトリス - ホウ酸、pHが8.3、1 mMのEDTA）および蒸留脱イオン水30mlを120mlのを追加します。
   2. 3分（ - 沸騰後60秒以上または40）のための電子レンジ。 2％アガロースゲル中の濃度を維持するのに役立つ水30mlの添加により蒸発中に失われた水分を補給。
   3. 冷水浴中で1分間、ビーカーの内容物を渦巻。 1.2 MのMgCl ₂ 1mlを（ゲル中の10mMのMgCl ₂濃度を作るために）追加し、ゲルウィットを前染色SYBR安全色素のH 6μL（1：20,000）。
   4. 乾燥ゲルボックスにゲル溶液を注ぎ、厚さ1.5mmの12ウェルゲル電気泳動コームを挿入します。でも、プラットフォーム上で30分 - 溶液を15のために固化してみましょう。
   5. ゲルボックスにゲルランニングバッファー（44.5 mMトリス-ホウ酸、pHが8.3、1 mMのEDTA、および10mMのMgCl _2）を注ぎます。負荷2 - アガロースゲルのウェルに1キロバイトのDNAラダーを3μl。分子キャンバスのサンプル20μlの6Xのブロモフェノールブルー色素（0.25％ブロモフェノールブルー、5 mMトリス、1mMのEDTA、10mMのMgCl ₂を、30％グリセロール）の4μLを混合し、ウェル別にソリューションをロードアガロースゲル。
5. 氷水浴中で100 Vで2時間のネイティブ2％アガロースを実行します（それは時間を実行している場合は2時間が適切であることを指標とすることができるように青で示さブロモフェノールブルーは、速い成分の鎖よりも実行されます）。
6. 画像ゲルをSYBR安全な染色（ 図2Bのための適切なフィルターを用いてゲルスキャナーを使用して、 ）。
7. 青色光トランスイルミネーター上で、シャープなきれいなカミソリの刃を用いて、1 kbのDNAラダーの1,500塩基対のバンドに類似した移動度を有する支配的なバンドを切り出します。スピンカラムに所望のゲル片（複数可）を配置し、マイクロチューブ乳棒を用いて微細片にゲルを粉砕。 4℃で3分間、438×gで遠心分離します。
8. 260nmでの紫外線分光光度計を用いてDNAの濃度を測定します。
   1. マシンを較正するためにブランクとして超純DNアーゼ/​​ RNaseフリー蒸留水2μLを使用してください。
   2. DNA濃度の推定値を得るためにスピンカラムから採取した試料の等量を使用してください。 260 nmでのUV吸収で得られた測定濃度値（ "" = NG /μl）を、AFMおよびTEMイメージングのための希釈係数を判断するのに役立ちます。
   3. b。次の「B」（nm）に「A」（ng /μLで）から測定された濃度=×10 ⁶ /（330変換します＆＃215;ヌクレオチドの数）。
      注：ヌクレオチドの分子量は330グラム/モルです。計算されたモル濃度値は、AFM及びTEMイメージングのために希釈係数を決定します。 60 ng /μLで - 28T矩形×24Hの場合については、精製された試料についての一般的な測定値は約10です。 12 nMの - そのような構造体のヌクレオチド数は14616 Daがあるので、モル濃度は約2です。最終濃度は、収集収率によって決定される - 遠心分離し、ゲルのバンドのボリュームから（〜20〜50％）（体積が大きいほど、より精製された試料を希釈）切り出し。

3.原子間力顕微鏡イメージング

1. 平坦な表面を取得し、撮影台上に試料ディスクを配置するためにスコッチテープを使用して試料の金属板に取り付けられたマイカをはがし。
2. 28T×24Hの精製試料の - （5 nMの2）5μlを、続いて1×アニーリング緩衝液Aの40μLを追加新鮮に切断雲母表面に長方形。混合物を約2分間沈降することができます。
3. カンチレバーホルダーにAFM窒化シリコンカンチレバーチップを取り付けます。 C三角形のヒント_（0 = 40共振周波数f、 - 75 kHzのを、ばね定数k = 0.24ナノメートル^-1）イメージングのため。
4. 画像流体タッピングモードのサンプル。 - 1ヘルツ（ 図2C）スキャン2μmのサイズ、解像度1024ライン、および0.5のスキャン速度：スキャンについては、次の撮像パラメータを使用してください。
5. 必要に応じて^、29を結合DNA、マイカの強度を増加させるために10μL以上の10mMののNiCl ₂溶液を加えます。

ストレプトアビジン標識のため4.サンプル調製

1. 手動で特定の位置にハンドルストランドが順番にstreptavidに結合することが可能であるビオチン修飾を有する抗ハンドル鎖に相補的であるように組み込まれているように、28Tの長方形×24Hを設計具体的で。
   1. 底部には一番上の行に14のタイルと14タイルにスペーサーとして二塩基配列（TT）で構成され、3 '17ヌクレオチドセグメントおよび15ヌクレオチドのハンドル（GGAAGGGATGGAGGA）を取り付けることにより、分子のキャンバスを変更長方形（ 図3A）の行は、境界を標識します。この配列は、3 'ビオチン修飾抗ハンドルストランド（TCCTCCATCCCTTCCビオチン）に相補的です。
2. 内部標識のために、8つの内部のタイルと長方形（ 図4A）の6境界タイルに3 '17ヌクレオチドセグメントを接続します。
   1. 200 nMのストック溶液を作るために28Tの長方形（334ストランド）×24Hの成分の鎖の残りの部分とハンドル（境界標識）と28本の鎖を混ぜます。 200 nMのストック溶液を得るために、28Tの長方形（348ストランド）×24Hの成分の鎖の残りの部分とハンドル付き14ストランド（内部標識）を混ぜます。
3. BOのためundaryラベリング、0.1に鎖の200 nMのストック溶液50μl、100μMのビオチン修飾抗ハンドルストランドの6μlを、10×アニーリング緩衝液A、および蒸留脱イオン水34μlに10μlを添加する - 0.2 mlのPCR試験管。成分鎖の最終濃度は100nMであり、抗ハンドルビオチン修飾された鎖の最終濃度は6,000 nMです。抗ハンドルビオチン修飾された鎖が結合が良好にするために、100％を超えているので、28T矩形×24Hに抗ハンドルビオチン修飾された鎖の結合の28分子ことに注意してください。
4. 内部標識のために、0.1に鎖の200 nMのストック溶液50μl、100μMで内部抗扱うビオチン修飾された鎖の3μlを、10×アニーリング緩衝液Aを10μl、蒸留脱イオン水を37μlを添加します - 0.2ミリリットルPCR試験管。成分鎖の最終濃度は、100 nmおよび抗ハンドルビオチンMODIFIの最終濃度であります ED鎖は3,000 nMです。 28Tの長方形×24Hに対する抗扱うビオチン修飾された鎖の結合の14分子が非常に抗ハンドルビオチン修飾された鎖が結合が良好にするために、100％を超えていることに注意してください。
5. 2.3で説明した手順を用いて、17時間、サーマルサイクラーに両方のサンプルをアニール。
6. ステップ2.4​​で説明したように、ネイティブ2％アガロースゲルを準備します。
7. ステップ2.5で説明したように、両方のサンプルを精製します。
8. ステップ2.6で説明したように、所望のDNA構造の濃度を測定します。

ストレプトアビジン標識のための5原子間力顕微鏡

1. イメージステップ3（ 図3Bおよび4B）に記載されるようにAFMを用いて、各サンプル。
2. 撮影の最初のラウンドの後、サンプルミリリットルの10mg /でストレプトアビジン1μLのに続いて1×アニーリング緩衝液Aの40μlを添加します。混合物は、（ 図3Cおよび図4C）を再イメージングする前に、約2分間沈降することができます。

_title "> 6。チューブに矩形を変換します

1. 四角形に基づいてチューブを設計するためには、上部と下部の行以外の場所でのコンポーネント海面水温のすべてを保持します。その海面水温チューブ立体構造（ 図5A）に、元の四角形を環化するために、それぞれの列の最上部と最下部の半タイルを連結することによって設計された新しい行を導入します。
2. 200 nMのストック溶液を得るために、上部と下部の行を除く28T矩形×24Hの成分ストランド（336ストランド）でストランドの新しい行（14ストランド）を混ぜます。
3. 2.7（ 図5B） -ゲル精製は、2.2ステップに従ってください。

7.透過型電子顕微鏡イメージング

1. 2％水性ギ酸ウラニル染色溶液を調製し、蒸留水3mlにウラニルギ0.06gのを秤量します。注射器に取り付けた0.2μmのフィルターを使用して、2％水溶液ウラニルギ染色液をフィルタリングします。
   1. の5μLを追加5 N NaOHをろ過染色溶液1mlに。簡単に説明すると20,000×gで溶液および遠心分離機をボルテックス。
2. 25ミリアンペア、45秒、0.1バール、負のハイテンション極性：グロー次の設定で炭素被覆グリッドを（コーティングされた側を上に）放電します。
3. エッジからのグロー放電処理されたグリッドをつかむために自己閉鎖鉗子を使用してください。
4. 4分間のグリッド上のサンプルの3.5μLをピペット。側からグリッドに接触して濾紙にすることによって、サンプルをオフに吸い上げるために、フィルタ紙を使用してください。
5. すぐに1分間のグリッド上に染色液の3.5μlを添加します。
6. ウィック7.4のように汚れをオフし、1グリッドに対するろ紙ホールド - 2分。
7. 10 Kから80 K（ 図5C）の範囲の倍率で80 kVので操作するJEOL JEM-1400を用いたTEM試料ホルダと、画像にグリッドを転送します。

8. Moleculを使用して任意の形状の構築ARキャンバス

1. 形状を特定し、分子キャンバス上の形状に対応ストランドを選択します。例えば三角形状の場合、分子のキャンバスのための206 362うちストランドを選択します。
2. 10ポリTセグメントと（つまり三角形の斜辺に沿って、ある）が露出ドメインを置換する- 11ヌクレオチドの長さ（ 図6Aの設計1）、または露出したドメインに相補的であるエッジプロテクターを追加し、それを終了します10 -凝集を防止するために、11ヌクレオチド長のポリTセグメント（ 図6Aの設計2）。
   注：単純に（プロテクターストランドを使用せずに）三角形の画素に対応するSSTをアニールは、凝集、ゲル上の明確な生成物のバンドの形成につながります。それは多くのリソースが効率的であるように、様々な形状のため、エッジプロテクターのデザインを使用します。それはFIGUR（交換の設計でさらに14組に比べて、鎖の唯一の4つの追加セット（ 図6C）が必要ですE 6B）。
3. コアセット（362 SSTキャン​​バス）、セット1 *（SSTのドメイン1に結合エッジプロテクター）を含む310ピクセル分子キャンバス、ドメイン2に結合するセット2 *（エッジプロテクターのための鎖ライブラリーを作成します。 SST）の、SSTのドメイン3に結合する3 *（エッジプロテクター）を設定し、設定は4 *（SSTのドメイン4）に結合するエッジプロテクターは1344エッジプロテクターの合計を与えるために。
4. 約10秒ごとに異なる​​セットの96ウェルプレートを遠心します。ピペットうち、特定の形状のためのストック溶液を作製するために、プレートから所望の鎖。
   1. エッジプロテクター、ピペット2ミリリットルの遠心分離に1コアセットから206ストランドのμL、0セット1 *から、0セット2 *から、セット3 *から0とセット4 *から24ストランドと三角形の形状チューブ。 DNA鎖の400 nMのストック溶液を作製するために、チューブに蒸留脱イオン水20μlを加えます。
5. DNAストラの400 nMのストック溶液50μlを追加します。 NDS、10×アニーリング緩衝液B（50 mMトリス、pHが7.9、10mMのEDTA、125のMgCl _2）ストック溶液および40μlの10μlを0.2ミリリットルのPCRチューブに、脱イオンH ₂ Oを蒸留しました。これは、鎖当たり約200 nMの濃度のストランドと1Xアニーリング緩衝液B（5 mMトリス、pHが7.9、1 mMのEDTA、12.5のMgCl _2）中の三角形の100μlのサンプルになります。
6. ステップ2.3で説明したように17時間のためのサーマルサイクラーで、混合物をアニール。
7. ステップ2.4​​で説明したように、ネイティブ2％アガロースゲルを準備します。
8. ステップ2.5で説明したように、サンプルを精製します。
9. ステップ2.6で説明したように、DNAの濃度を測定します。
10. 画像ステップ3で説明したようにAFM下でのサンプル（ 図7Cおよび7D）。
11. ピックと同じ鎖ライブラリーを使用して異なる形状のためのストランドを混ぜます。さまざまなソリューションをアニールし、AFMイメージング時間を節約するために、異なる形状の精製されたサンプルを結合。

jove_title "> 9オプション：シェイプ·デザインと液体混合のロボットオートメーション

1. 複雑な形状の設計を支援するために、カスタムのMATLABプログラムを使用します。
2. ロボット液体ハンドラにピペッティング配列の形で指示を提供するためにソフトウェアを使用してください。選択して目標形状を構成するストランドを混合するためのロボット液体ハンドラを使用してください。
   注：形状設計および鎖混合は、人的エラーを削減し、建設少ない労働集約するために自動化しました。

10.四角形とさまざまなスケールアクロスチューブ

1. 単に平行ヘリックス（H）の数と螺旋巻き（T）の数を変えることによって異なるサイズの矩形（ 図10）を構築します。
2. 特定の大きさの長方形のためのステップ3に従ってください。
3. 特定のサイズのチューブのための手順6に従ってください。

結果

海面水温の自己集合（図1）は、図2に示すように、28T矩形×24Hをもたらす。別の海面水温のためのDNA配列は、ストレプトアビジン標識（図3及び4）の形質転換を可能にするように最適化/改変することができます様々なサイズのチューブや長方形を形成するためにチューブに長方形（ 図5）、海面水温のプログラム可能な自己集合（図10）?...

ディスカッション

構造形成工程では、自己組織化DNAナノ構造のDNA鎖の混合物（ 例えば 、15 mM）のマグネシウムカチオンの適切な濃度を維持することが重要です。同様に、アガロースゲル特性評価/精製工程では、ゲル電気泳動中にDNAナノ構造を保持するゲルランニング緩衝液中で、適切なマグネシウムカチオン濃度（ 例えば 、10ミリモル）を維持することが重要です。 28T矩形構造×24Hのために、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA Strands	Integrated DNA Technology		Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	S33102	Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns	BIO-RAD	731-6166	Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes	Bruker AFM Probes	SNL10	Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator	Invitrogen	G6600	Section 3.6
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428 000.414	Section 3.6
Transmission Electron Microscope	Jeol	Jem 1400	Section 7.4
Multimode 8	Veeco		Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner	GE Heathcare Life Sciences	28-9558-08	Section 3.5
Ultrapure Distilled water	Invitrogen	10977-023	Section 3.7.1
Mica disk	SPI Supplies	12001-26-2	Section 4.1
Steel mounting disk	Ted Pella, Inc.	16218	Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM	Electron Microscopy Sciences	FCF400-Cu	Section 7.2
tweezers	Dumont	0203-N5AC-PO	Section 7.31
glow discharge system	Quorum Technologies	K100X	Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler	BIO-RAD	PTC–0240G	Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	ThermoScientific	B2	Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G	Lonza	50004	Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp	ThermoScientific	SM1333	Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer	ThermoScientific		Section 3.7
0.2 um filter	Corning Inc.	431219	Section 7.1.2