実験的脊髄損傷における脊髄血流の評価のための強化された超音波画像コントラスト

要約

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

要約

減少脊髄血流（SCBF）（ すなわち、虚血）が外傷性脊髄損傷（SCI）病態生理学において重要な役割を果たし、それに応じて神経保護治療のための重要な標的です。いくつかの技術がSCBFを評価するために説明してきたが、それらはすべて重要な限界があります。後者を克服するために、我々は、リアルタイムの造影超音波イメージング（CEU）の使用を提案します。ここでは、SCIのラット挫傷モデルでは、この技術の応用について説明します。頸静脈カテーテルは第1のコントラスト剤、六フッ化硫黄カプセル化されたマイクロバブルの塩化ナトリウム溶液の反復注射のために注入されます。背骨は、カスタムメイド3Dフレームで安定化され、脊髄硬膜はThIX-ThXIIで椎弓切除術により露出されています。超音波プローブは、その後、（超音波ゲルで被覆された）、硬膜の後面に位置しています。コントラのベースラインSCBF、単回静脈内注射（400μl）を評価するために、STエージェントは、無傷の脊髄微小血管系を介してその通過を記録するために適用されます。重量落下装置は、その後、SCIの再現可能な実験的な挫傷モデルを生成するために使用されます。造影剤は、SCI後SCBFの変化を評価するための傷害後の再注入15分です。 CEUは、実時間及び生体内 SCI次SCBF変化を評価できます。無傷の動物では、超音波イメージングは​​、無傷の脊髄に沿って不均一な血流を示しました。 SCBFが複数のリモート無傷の領域に保存されたままながらさらに、15分後にSCIは、重要な虚血は、震源のレベルでした。震源地（吻側および尾側の両方）に隣接する領域では、SCBFが有意に減少しました。これは、前述の「虚血性ペナンブラ領域」に相当します。このツールは、虚血およびSCIの後に得られた組織の壊死を制限することを目的とした治療法の効果を評価するための主要な関心事です。

概要

外傷性脊髄損傷（SCI）は、感覚運動の著しい障害、自律機能をもたらす壊滅的な条件です。現在まで、治療は患者においてその効率を示さありませんでした。このような理由から、潜在的な治療法の評価を向上させる、さらなる傷害pathiophysiology ^1を解明することができる新たな技術を特定することが重要です。

SCIは、一次および二次傷害と呼ばれる、2つの連続相に分割されます。主な損傷は初期の機械的損傷に対応しています。さらに初期病変、組織損傷、したがって、神経学的欠損の^2,3の進行拡大に貢献二次的損傷群（例えば、炎症、酸化ストレスおよび低酸素など）様々な生物学的事象のカスケード一方。

SCIの急性期では、神経保護療法は二次的損傷の病理およびSHを減少させることを目的としていますそれに応じて神経学的転帰を改善ウルド。多くの二次的損傷のイベントの中では、虚血は重要な役割^を果たしている^4,5。 SCIの震源地のレベルでは、損傷した実質微小血管は、効果的な脊髄血流（SCBF）を妨げます。また、SCBFも著しく損傷震源、特に「虚血性ペナンブラゾーン」として知られている領域を囲む領域において減少します。 SCBFはすぐにこれらの領域内に復元することができない場合、虚血は、補助実質壊死、さらに神経組織の損傷につながることができます。少しでも組織保存機能の実質的な効果を持つことができるように、それは虚血後SCIを減らすことができる薬物と治療法を開発するための主要な関心事です。この現象を強調表示するには、以前の研究は、有髄軸索の10％のみの保存が猫のポストSCI ⁶で歩行を可能にするのに十分であったことを示しています。

いくつかの技術がSCBFを評価するために説明してきたが、Yはすべての重要な制限があります。例えば、放射性ミクロスフェアの使用^7,8及びC14-iodopyrineオートラジオグラフィー^9は、その後、動物の犠牲を必要とし、それ以降の時点で繰り返すことはできません。水素クリアランス法^10は、脊髄に損傷を与える可能性髄腔内電極の挿入に依存します。レーザードップラー画像化は^、14,15フォトプレチスモグラフィおよびインビボ光学顕微鏡^16は、測定^11-13の非常に限られた深さ/面積を有します。

我々のチームは、以前に造影超音波（CEU）イメージングは、ラット脊髄実質¹⁷内SCBF変化をリアルタイムに評価し、 生体内に使用することができることを示しています。これは、同様の技術が黄らにより適用されたことに留意することが重要である。SCI ¹⁸のブタモデルにおいて。 CEUは、グレースケール形態学的IMを関連付けることができる超音波イメージングの特定のモードを適用します血流¹⁹の空間分布と年齢（従来のBモードによって得られました）。 SCBFイメージングおよび定量化は、エコー造影剤の血管内注射に依存します。造影剤は、リン脂質によって安定化（約2.5ミクロンの平均直径と90％が6ミクロン未満の直径を有する）、六フッ化硫黄の微小気泡から構成されています。マイクロバブルは、このように血液エコー源性を高め、彼らの血流に応じて、組織のコントラストを大きくするプローブによって放出される超音波ビームを反射します。これは、反射された信号の強度に応じて関心のある領域内の血流を評価することができます。マイクロバブルはまた、安全であり、彼らは、臨床的にヒトで適用されています。六フッ化硫黄を迅速にクリアされ（半減期は12分であることを意味する）と投与六フッ化硫黄の80％以上は、注射後2分以内に呼気中に回収されます。このプロトコルは、CEU、IMを使用するための簡単​​な方法を提供しますラットにおけるSCBFの変化を評価するために高齢化。

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プロトコル

注：この原稿に記載された方法は、医学、パリ、フランス（CEEALV / 2011-08-01）のLariboisière学校の生命倫理委員会によって承認されました。

1.機器の準備

1. マイクロ鉗子、マイクロはさみ、マイクロ血管クランプ、大きなはさみ、外科用糸（黒編み絹4-0）と14 Gカテーテル：カテーテル挿入のために、以下の機器を準備し、清掃してください。ヘパリン溶液（5,000 U / ml）でカテーテルをヘパリンで治療します。
2. 大きなはさみ、メスと骨カッター：椎弓切除のため、以下の機器を準備し、清掃してください。椎弓切除術（ 図1）の間に、脊髄を傷つけるのリスクを軽減するように設計されたカスタムメイドの骨カッターで椎弓切除術を行います。
3. セットアップ動物の位置決めおよび安定化のために使用される3D-フレームを。カスタムメイドフレームは、鉗子に関連して創外固定器ホフマン3の要素で構築され、whichは、動物の腰椎を適合させるために湾曲されています。
4. 脊髄損傷生体力学的に使用される重量ドロップデバイス（インパクター）を準備します。
   注：カスタムメイドインパクション装​​置は、3Dソフトウェアで設計し、3Dで印刷しました。
5. 超音波装置の電源をオンにします。
6. 造影剤の再構成するためのキットを準備します。
   注：このキットは、凍結乾燥粉末25mgを5mlの塩化ナトリウムと一つのミニスパイク転送システム（ 図2）を含む1プレフィルドシリンジを含む1バイアルを含みます。造影剤の再構成のための手順は、（第5節で）以下に詳述されています。

2.頚静脈カテーテル（図3）

1. 4％のイソフルランで動物を麻酔 。仰臥位で動物を置きます。足をピンセットでつまみされたときに動物が応答しないことを保証することにより、適切な麻酔を確認してください。ウントしながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用しますER麻酔。
2. 首を剃るし、肌をきれいにします。首の正中線に切開を行います。内頸静脈を見つけるためにsternocleidomastoidian筋肉を撤回。静脈の吻側部に結紮糸を締めます。
3. 静脈、合字より1cm下の微小血管クランプを適用します。ちょうどクランプが解除されたとき締めする準備ができて結び目とクランプの下、静脈の周囲に別のスレッドを渡します。
4. クランプと吻側合字間静脈（静脈切開）の壁を開きます。静脈の内腔に14 Gカテーテルを導入し、心臓に向かって押し込みます。
5. それは、クランプに対して起動すると、後者を解放し、さらに、カテーテルを押してください。しっかりと内側カテーテルを用いて静脈に結び目を締めて、静脈にカテーテルを固定します。
6. カテーテルに静脈血の少量を回収し、続いて、その後ヘパリン化生理食塩水でそれをフラッシュすることによって、カテーテルの開存性を評価します。これは、Cの閉塞を防止します潜在的な血液凝固によってatheter。
7. 造影剤（マイクロバブル）のさらなる注入のためのカテーテルにフレキシブルチューブを接続します。使用するための準備ができるまで（封入）することが閉じておいてください。

3.脊椎へのアクセス、椎弓切除およびラットポジショニング（3D-フレーム内）

1. フラット傾向が水平位置に動物を配置します。剃ると動物の背中（胸部）を清掃してください。
2. 触診（ 図4）によって、最後の肋骨（ラットでXIIIth）を特定します。これは、1つはXIIIth胸椎（ThXIII）の位置を推定することができます。
3. ThXIIIを中心に正中線では4センチ皮膚切開を作ります。皮膚切開だけでなく、基礎となる嚢を開きます。背中の筋肉の腱膜ならびに椎骨棘プロセスのヒントを確認します。
4. 慎重XIIIthリブを触診することによりThXIIIの背骨プロセスをローカライズ。
   注：XIIIthリブがThXIIIに接続され、したがって、LOCAに簡単にを表しますThXIIIの同定のための解剖学的ランドマークをTE。このステップは、ThIX棘突起ならびにL1およびL2（第1、第2腰椎の椎骨）にThXIIの局在化を可能にします。
5. 筋肉の腱膜をカットし、L2にThIXから棘突起、ラミナや椎間関節を露出させるためにいずれかの側に筋肉を切り離します。横突起から筋肉を取り外すことにより、L1、L2の横方向の側面を露出させます。
6. 位置（ 図5）を確保するために、3Dフレームに動物の切歯を引っ掛けます。修正された鉗子でL1とL2椎骨を固定します。動物を安定させるために3D-フレームに変更された鉗子を接続します。
7. ゆっくり脊椎全体を強化するとベンチから胸部を上昇させるために、尾側に腰椎を保持鉗子を引きます。
   注：記載の構成では、動物が呼吸することができる必要があります。また、胸郭、背骨や脊髄の呼吸運動にもかかわらず、コー​​ドはまた、不動のままであるべきです。
8. ThIXからThXIIに棘processessを削除します。ゆっくりThXIIの左ラミナ下に骨カッターの劣るブレードを挿入した後、薄層（ 図6）を切断するために骨のカッターを閉じます。
9. 右ラミナに同じ操縦を繰り返し、順次後方アーチを削除します。 4レベルの椎弓切除を達成するためにThIXに椎骨のThXI、前の手順を繰り返します。各椎骨のための両方の椎間関節を外します。
   注：手順では、地元の出血から術野を清掃してください。そのためには、ぬるい食塩水で綿棒や灌漑を使用しています。止血は系統的に数分以内に起こります。

4. CEUプローブポジショニング

1. 超音波ゲルと硬膜をカバーしています。これは、プローブと脊髄（ 図7）との間の超音波の効果的な伝達を可能にします。
2. 超音波プローブのウィットを安定させますその後、多関節アームによって、3Dフレームに接続することができヘクタールクランプ。手動でプローブを配置します。プローブを斜め縦矢状スライスを取得するように配向されていることを確認します。正しい位置に、脊髄は、画像に厳密に水平であり、脊髄の中心管は、脊髄の完全なセグメントに沿って表示されます。
   注：位置決めは、超音波装置の画面に表示されるリアルタイムのBモード画像によって案内されるべきです。超音波プローブの焦点距離は、脊髄の中心管と整列されるべきです。このとき、脊髄の後面は、最終的にインパクターの位置決めを可能にするどのアクセス可能です。
3. ときに最適な、位置を安定させるために多関節アームをロックします。

造影剤の5準備 - マイクロバブルの再構成

1. 商用再構築キットの内容を使用し、TIG、それを固定することにより、プランジャーロッドを接続htlyシリンジ（時計回り）に。転送システムのブリスターを開き、シリンジ先端キャップを取り外します。転送方式キャップを開き、（しっかり固定）転送システムに注射器を接続します。
2. バイアルから保護ディスクを取り出します。の透明スリーブにバイアルをスライドさせ
3. しっかりと所定の位置にバイアルをロックする搬送システム、を押します。
4. プランジ​​ャーロッドに押して、バイアルにシリンジの内容物を空にします。乳白色均質な液体を得るために、バイアル内のすべての内容物を混合するために20秒間激しく振ります。
5. システムを反転し、慎重にシリンジに造影剤を撤回。移送システムから注射器を外します。 （指示されたように）再構成した後、得られた分散液1 mlをマイクロバブルで8μlの六フッ化硫黄が含まれています。 100ミリリットルの注射器にマイクロバブルの懸濁液を描画します。電動ポンプに100ミリリットル注射器を挿入します。ふたを閉じます。
6. 再の一定の攪拌を開始しますマイクロバブルを構成しました。マイクロバブル懸濁液を維持し、シリンジの低速回転により一定の攪拌を得ました。フレキシブルチューブを介して頸静脈カテーテルにポンプを接続します。 「ハーモニックモード」に超音波装置を設定します。
   注：後者はマイクロバブルを特異的に検出し、可視化することができるモードに対応します。このモードは、Bモードとは対照的に、マイクロバブルを破壊しない低メカニカルインデックスを持っています。
7. 造影剤の最初の投与量（400μl）を注入することにより、カテーテルをパージします。この最初の注入時には、マイクロバブルは、超音波画面に表示されないことを確認してください。これは、（ラットの血流への注射器から）回路全体が無傷で開いていることを確認します。
8. 脊髄実質および血流中に残っているいくつかのマイクロバブルの破壊を可視化する「Bモード」に超音波装置を設定します。 「Bモード」の高周波トラン破壊にそれらを可能にするマイクロバブルにスミッツ高エネルギー、。
9. 動物は約30分間、まだ横たわってみましょう。この期間は、血行動態パラメータの安定化を可能にします。

無傷の脊髄におけるSCBFの6評価

1. 「ハーモニックモード」に超音波装置を設定します。同時に造影剤の（1）注入（400μL）および（2）クロノメーターを起動します。
   注：点滴中に、血流中のマイクロバブルの濃度は、脊髄（ 図8）のコントラスト想像を可能にする、増やす必要があります。マイクロバブルを迅速に破壊されるので、マイクロバブルの血中濃度は、注射は、脊髄のコントラスト視覚化の漸進的な減少を生成する完了すると減少し始めます。
2. 1分後、超音波マシン上（プレス）「クリップストア」ボタンを選択します。これは、Rの1分を保存することを可能にしますAW超音波データと撮像動画記録（それは、以前に超音波画面上に表示されました）。
3. 「Bモード」に超音波装置を設定します。これは、残りの微小気泡を除去することができます。

7.実験SCI

1. 3Dフレームに接続されたマイクロマニピュレーターを用いてインパクタの先端が硬膜に接触するように、（脊髄正中線上に）重量落下衝撃装置を配置、THXとThXI（ 図9）との間の接合部で。
   注：このレベルでは、超音波装置を用いて観察脊髄のセグメントの中央に対応する必要があります。ストライカーとインパクターの本体は直径8mmです。損傷が発生しますインパクターの先端には、直径3mmです。
2. を10cm高い位置に衝撃装置のストライカーを置きます。衝撃装置のストライカーを放出することによって、実験SCIを誘導します。ストライカーが低下し、目をリリースEインパクター、脊髄を負傷しました。カスタムメイドの衝突は、10グラムの重量への影響当量が10cmの高さから落下提供しています。

SCBF 5分後のSCIの8評価

1. セクション6（SCBFの評価）に記載の手順を繰り返します。マイクロバブルは、損傷した微小血管系を通過することができなくなり、けがの震源地は（ 図10）暗いままになります。

9.動物の犠牲

1. ペントバルビタールの腹腔内致死注射（100 mg）を用いて動物を安楽死させます。

10オフライン分析によるSCBFの定量

1. （超音波マシン上の）定量化のために使用される超拡張ソフトウェアを起動します。 「 ファイル 」 を選択し、以前に保存された生データを選択して、関連ファイルを開きます。 「 カイQ」ボタン（選択）を押して「 定量モード 」 を有効にします。セレCT」 セットROI」（ボタン）と円形の形状を選択します。
2. 「ROIを描画 」を選択（ボタン）および脊髄（ 図11）に興味のある7、隣接する円形の領域（ROI）を描画します。 「 フィッティング 」メニューを開き、「 曲線値 "機能を選択します。各ROI内のマイクロバブル濃度の変化に対応し、いくつかの曲線を表示するソフトウェアを確認します。
   注：各曲線は、「灌流deperfusion」プロファイルを有します。曲線の最初のフェーズでは、平坦であり、マイクロバブルの到着までの期間に相当します。第二段階では、マイクロバブルの濃度が急速に注入の結果として増加します。彼らは血流中disintegratseとして注入が完了したときに始まる第三段階では、マイクロバブルの濃度が次第に低下します。
3. Cの第二フェーズの開始時に第1の垂直線を配置urveと「SET」を選択します。これは、分析を開始するためのソフトウェアに通知します。
4. 記録の終了時に、第2の垂直線を配置し、再び「SET」を選択します。これは、分析を停止するためのソフトウェアに通知します。
5. 「Cv値 」メニューを見て、分析し、「 曲線下面積 」に相当する「AUC」の値を、記録します。この値は、対応するROI内部SCBFに比例しています。

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結果

プロトコルは、上記によれば、長手脊椎矢状セグメントに沿っSCBFをマッピングすることが可能です。

無傷の脊髄では、実質（ 図12）内のSCBFむらがあるように思われます。これは、1つの動物から別のradiculo、髄質動脈（RMA）の可変分布によって説明することができます。 RMAは、前脊髄動脈（ASA）に達する動脈分節ので、脊髄実質への血液供給を提供すること...

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ディスカッション

我々はラットSCI挫傷モデルでCEUを使用する方法を記載しているが、このプロトコルは、他の実験の目的またはSCIモデルに適合するように修正することができます。我々は、2つの時点（損傷前と15分後SCI）、時間点の数がでSCBFを測定することを選択したとSCBF測定値との間の遅延は、他の研究の必要性を満たすように構成することができます。たとえば、私たちの以前の研究¹⁷で、我々?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job