ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

要約

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

要約

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

概要

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

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プロトコル

ジョージア大学の治験審査委員会は、健康なボランティア（UGAの＃2012-10769-06）から末梢血を収集するために、ヒト対象の研究を承認した^。5,7,8ボランティアは、採血前に必要なインフォームドコンセントフォームに署名しました。この記事で行った研究は、ヘルシンキ宣言のヒトを対象とする医学研究のための倫理ガイドラインに準拠しています。

末梢ヒト血液からの好中球の1の単離（図1）

注：末梢血から好中球を分離する方法はいくつかあります。以下のプロトコルは、一つの可能​​性を提供します。このプロトコルは、外部刺激によりネットを放出することができる非活性化ヒト好​​中球を大量に得られます。 40ミリリットル静脈穿刺することにより、健康なボランティアから得た全血を使用してください^。7,9

1. 2 50mlコニカルチューブに小分けし20ミリリットルの血液。 10ミリリットル6％デキストランを追加します。穏やかに混合します。
2. 20分には、白血球RICを転送した後、きれいな50mlコニカルチューブに任意のペレット化赤血球を取り、滅菌PBSでそれを埋めることなく、時間上相。
3. 400×gで10分で遠心分離します。 4ミリリットル滅菌PBSで再懸濁ペレット。
4. コニカルチューブと各勾配の上の層2ミリリットルの白血球サスペンション2 15mlに85％-80％-75％-70％-65％の5段階パーコール勾配を準備します。
5. ブレーキをオフにした状態で30分間遠心分離800×gで。
6. 80分の75％〜70％/ 75％の界面で層内のすべてのセル（好中球）を収集します。
7. （350×gで、10分、RT）PBSで2回細胞を洗浄し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。

マイクロプレート蛍光光度計を用いて細胞外DNA放出動態の2.測定

注：この方法は、96ウェルマイクロプレート形式でのDNAの放出（ 図2）を示し、膜不透過性DNA結合色素の蛍光の変化を測定することができます。

1. アッセイ培地中で好中球の懸濁液を調製（HBSS +2×10 ⁶細胞/ mlの濃度で1％（v / v）の自己血清+ 5mMグルコース）。
2. 膜不透過性DNA結合色素の5マイクロモル/ Lを追加します。穏やかに混合します。
3. 小分けしたヒト好中球（50μL/ウェル）を96ウェル黒色、透明底の上にマイクロプレート。アッセイ培地は、ウェルの底部全体を覆っていることを確認してください。ない場合は、サイドを軽くプレートをタップします。
4. 37℃で10分間、好中球を含むプレートをウォームアップ。
5. その間に（37°C暖かいアッセイ培地中で）使用するそれらの最終濃度の二重で刺激の溶液を調製します。ポジティブNETコントロールは最大NETの放出を誘発するために4時間100nMのホルボールミリステートアセテート（PMA）でヒト好中球を使用するように自発的なNET形成が低い^5,8をまま。4時間^5,8 PMA刺激は、最大NETのリリースを保証します。
6. 測定用のマイクロプレート蛍光光度計（4時間、37℃、励起および発光のための590 nmの530 nm）を準備します。
7. 50μlの好中球懸濁液に50μlの刺激溶液を添加することによって、好中球を刺激します。最大のDNA解除信号を測定するための1つのウェル中の0​​.5μg/ mlのサポニンを使用してください。
8. リーダーにプレートを置きなしに振盪しながら、2分毎に4時間蛍光の変化を測定します。
9. データ解析のために、経時的な蛍光の正規化された増加を計算します。
   1. サポニンを含むすべてのウェルのエンドポイント値から減算基準蛍光（ 図2A、B）。サポニン蛍光の上昇が最も高い信号でなければなりません。これは、「最大のDNAの放出」（ 図2A）と呼ばれます。
   2. 最大のDNAの放出により、未知の試料の蛍光の増加を分割することによって、未知の試料中のDNAの放出の割合を計算します。
   3. 反復試験の平均結果とは、「最大のDNA放出の％」（ 図2C）としてそれらを提示します。

NETフォームの3定量MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイによってエーション

注：私たちの研究室でこれらの修飾されたアッセイ（MPO-DNA）または（HNE-DNA）を設立は、MPO-DNAとHNE-DNA複合体のレベルを測定することにより、NET形成を定量^5。

1. コー​​ト96ウェル高結合一晩捕捉抗体（50μL/ウェル）容量ELISAプレートを抗MPO（1：2,000希釈）または抗HNE（1：2,000）。
2. PBSで洗浄ELISAは、プレートを三回（200μL/ウェル）、室温で2時間、5％BSAおよび0.1％ヒト血清アルブミンでそれらをブロックし（200μL/ウェル）。 PBSで3回洗浄します。
3. 種子上で96ウェルマイクロ100μl/ウェルのアッセイ培地中100,000細胞の密度で、好中球、およびNET形成を刺激します。細胞をインキュベート：37°Cで4時間。
4. 好中球の上清に2 U / mlのDNアーゼを添加することにより、限られたDNase消化を行い、それらをよく混ぜます。室温で保管してください。
5. 11μlの25 mMのEGTA（最終濃度2.5 mMの）を添加することによって15分後にDNアーゼを停止します。よく混ぜます。 suコマンドを収集きれいな微量遠心管でpernatants。スピン試料は、室温で5分間、300×gで細胞破片を取り除くために。きれいなマイクロチューブの中にそれらの上清を移します。準備が整うまで氷上で保管してください。
6. 先に調製した「NET標準」のアリコートを使用してください。
   注：NET-標準は、少なくとも5つの異なる、独立したヒトのドナーから採取PMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清のミックスです。
   1. 長い間、同じ規格を使用するには、各個々のドナーからの好中球の上清を大量に収集し、分取。例えばPMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清の2ミリリットルを収集する200 ELISAプレートのための十分な200アリコート（10μlの各）になります。 NET規格を特徴付けるデータは、 図5に見られます。
   2. 4時間100nMのPMAでヒト好中球を刺激し、ステップ3.4から3.5記載のそれらの上清にDNアーゼダイジェストを適用します。
   3. 収集し、プール、アリコート（10μL）および無料ZE（-20°C）、好中球の上清。
   4. 少なくとも5つの別々のドナーから得られた1つのアリコート/ドナー解凍、「標準NET」を作製するには、それらを混合し、氷上で保管してください。
   5. 解凍したサンプルを破棄し、次の実験のために新鮮なものを使用します。
   6. PBS + EGTAでNET-標準の2連続希釈：1を準備します。
7. DNase1消化サンプル（標準および未知の上清）をPBS + EGTAで20倍に希釈し、捕捉抗体でコーティングしたELISAプレート上に分注し。
8. 4°Cで一晩ELISAプレートをインキュベートし、PBSでそれらを3回洗浄します。
9. 検出抗体溶液を適用し（100μl/ウェル）：ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗DNA抗体（1：500、マウス）。暗所で1時間インキュベートします。
10. 100μl/ウェル、30分：PBSで4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質を追加します。ブルー着色はペルオキシダーゼ活性（現在のNET）の指標です。
11. 100μl/ウェルの1MのHClを加えて反応を停止します。ザ青のソリューションは、黄色（ 図5A）を回します。
12. マイクロプレート光度計を用いて450nmでの吸光度を読みます。
13. データ分析のために、NETの標準と比較して、MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体の量を計算します。
    1. すべてのサンプルからのアッセイ培地のバックグラウンド光学密度値を差し引きます。
    2. それらの相対的なネットコンテンツ（Y軸）（ 図5A）に対して希釈標準試料の吸光度値（X軸）のプロット。
    3. この標準曲線の非飽和範囲を使用すると（ 図5A）（使用したソフトウェアから最良指数フィットを使用）トレンドラインを確立します。このトレンドラインの式はのNETの定量的な量にOD値の変換を決定します。
    4. NET-標準（ 図5A）の割合として未知試料中のNETの量を与えます3.13.3からのトレンドライン式に未知数の測定OD値を挿入します。
    5. 計算複製（三重）の平均値と（ 図5C）「MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体（標準の％）の量」として、最終的なデータを提示します。

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結果

この原稿の図では、好中球の分離、実験手順、およびデータ分析の説明に存在する代表的な結果の方法を説明する。 図1は、ヒト好中球の準備の逐次工程を示しています。このプロトコルは、好中球の分離の唯一の1つの可能な方法を表しています。これは、刺激の際にネットを放出することができる好中球を休んを大量に生み出す。蛍光ベースのDNA放出?...

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ディスカッション

ネットは好中球が病原体を殺すことにより、魅力的な新たなメカニズムを表しています^。1のNETの文献は継続的に発見以来、過去10年間にわたって拡大してきたが、生物学、機構及び調節におけるその役割に関連するいくつかの重要な問題は不明のまま。適切な方法論はネット、この非常にユニークな抗菌メカニズムを測定するために開発されなければなりません。この記事では、高?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603