モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

要約

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

要約

脊髄運動ニューロンの完全性に影響を及ぼす疾患は、最も衰弱性の神経学的状態の間です。過去数十年にわたり、これらの神経筋障害のいくつかの動物モデルの開発は、これらの条件の進行を遅延または逆転を狙っ異なる治療シナリオを科学コミュニティを提供しています。ニューロンの逆行性機構を利用することにより、これらのアプローチの一つは、脊髄運動ニューロンに対応するシャトル治療遺伝子のために、骨格筋を標的とするようになっています。一度有望が、このような遺伝子送達アプローチの成功は、これまでに得示した形質導入運動ニューロンのサブ最適数によって妨げられてきました。運動終板（のMEP）は、運動ニューロンα脊髄へ直接シナプス接触している骨格筋で高度に専門領域です。この点において、それは、これまで、努力は逆行することに注意することが重要です運動ニューロンへの転送遺伝子は、対象となる筋肉のMEP領域の位置を参照することなく行われました。ここでは、単純なプロトコル1）骨格筋の表面上のMEPの正確な位置を明らかにし、2）運動ニューロンへの筋肉内送達および逆行性トレーサーのその後の最適な逆行性輸送を案内するために、この情報を使用することが記載されています。我々は、欧州議会議員のターゲティングを介して脊髄運動ニューロンへの治療遺伝子の逆行性輸送を調査へのさらなる研究において、これらのトレース実験からの結果を利用したいと考えています。

概要

このような運動ニューロン疾患などの神経学的状態から生じる随意運動の制御の喪失とspinal-ならびにデュシェンヌ型筋萎縮症は、罹患者の毎日の生活に高く、長期的な影響を与える衰弱状態です。過去10年間、停止または少なくともこれらの神経筋疾患の有害な影響を遅らせることを目指して研究努力は、世界中の多くの臨床医と科学者のための優先事項となっています。この点で、これらの神経筋疾患を模倣する動物モデルの最近の発生は、これらの条件^1-13の発生および進行の根底にある生理学的メカニズムに基本的な洞察を得ることに尽力されています。これらの神経筋疾患の治療は、脊髄への直接アクセスを必要とし、脊髄注射^14,15によって達成することができます。遺伝子治療の最近の進歩は、上部の横紋筋肉を標的としていると脊髄^1,9-13の前角内に配置され、対応するα運動ニューロンへのシャトル治療遺伝子に下肢。しかし、このかつて有望な戦略は、これらの神経学的状態の結果を改善するために失敗しました。それは、これらの予後不良があり得ることを結論する公正であるが、少なくとも部分的に、これらの保護の遺伝子の低い有効性に起因する、1は、これらの遺伝子送達方法の低い有効性を除外することはできません。

モーターエンドプレート（議員）は、α運動ニューロンから発信大きな末梢運動線維の軸索末端でインデントされた骨格筋線維の専門領域です。一緒に、末梢神経線維終末とのMEPは、神経筋接合部、 すなわち 、シナプスインパルスは、神経伝達物質の順行性遊離、アセチルコリンによってトリガーされる部位を形成します。重要なことは、末梢神経線維とのMEPとの関係は、二DIRECです的な、別のモータが離れてニューロン細胞体^16-18から向かってだけでなく、分子や細胞小器官の輸送に関与しているが。これらの解剖学的考慮事項に照らして、MEPが対応する運動ニューロンへの送達および遺伝物質のその後の逆行性輸送のための選択の標的であることが表示されます。この文脈では、運動ニューロンの形質導入の成功は非常にウイルスベクターおよび筋肉の^19-20のMEPの筋肉内注射との間の距離に依存することは驚くべきことではありません。しかし、驚くべきことに、実験用ラットとマウスの筋線維のMEPゾーンの正確な位置は、選択の2種が神経筋疾患をモデル化するために、最近まで利用できませんでした。

我々は、ラットおよびマウス^21-22でいくつかの前肢の筋肉のためのMEP領域の総合的なマップを生成しています。最近では、我々はMEP rの組織の詳細を示していますマウス後肢²³のいくつかの筋肉のためのegion、我々は現在、ラットの後肢上のMEPの特徴を分析しています。私たちの手では、これらの筋肉全体MEPゾーンに向かう逆行性トレーサーの筋肉内注射は、以前に報告されたよりも多くの脊髄セグメントをスパニングしている以上の標識運動ニューロンを生じさせました。ここでは、外部表面上のMEPの位置だけでなく、マウスおよびラットの両方における後肢と前肢の筋肉の深さ全体を明らかにするために、ここ数年にわたって開発されたプロトコルを提示します。

プロトコル

ここで説明する全ての実験手順は、UNSWオーストラリアの動物実験倫理委員会を遵守し、国民健康と動物実験のための医学研究評議会、オーストラリアの規制に準拠して実施しました。このプロトコルのすべての手順は、関連する動物実験倫理委員会の要求に応じて行われるべきです。

1.アセチルコリンエステラーゼ組織化学染色

1. アセチルコリンエステラーゼの反応液を調製
   1. 0.1Mリン酸緩衝液（PB）200mlにアセチルチオコリンヨージド290mgの追加。 900 rpmで磁気攪拌機で混合します。
   2. 連続的に攪拌しながら、グリシン600mgのを追加します。
   3. 生成物が完全に溶解するまでゆっくりと連続的に攪拌しながら反応混合物に硫酸銅の420ミリグラムを加えます。
2. 動物の死体の皮膚を削除切開を行うことで、（組織の共有を介して得られます）灌流ラットまたはマウスの皮膚へ、首の領域から肌を把握し、その足を過ぎてそれを引っ張ります。各筋肉を覆う筋膜が除去されたか、大幅に反応液に筋線維の十分な曝露を確実にするために穿孔のいずれかであることを確認してください。
3. 反応混合物に関心の全体または手足を浸し、4℃でO / Nインキュベート。
4. 蒸留水で2分間の死体を洗ってください。注：この段階では、筋肉は、青色の着色を示し、運動終板（のMEP）が白い点として見ることができます。
5. 3-5秒間10％の硫化アンモニウム溶液に死体を公開します。
   注：筋線維は、急速に褐色に変わり、MEPが黒い斑点ドットとして観察可能になります。反応があまりにも急速に発生し、筋線維が議員と筋線維を区別するために暗すぎる染色されている場合は硫化アンモニウム溶液（ 例えば 5％）のより低い濃度を使用してみてください。反応時間は、取得します議員と筋線維の間の最適なコントラストは、一つのサンプルから他に変化します。したがって、試薬に正確な露光時間を規定することは困難です。コントラストが十分なものとみなされたときの反応は、厳密に監視して停止する必要があります。
6. 蒸留水に攪拌しながら、カーカスを2回洗浄し、穏やかにカーカスドライバッチリ。
7. 関心のあるすべての筋肉のためのMEPが捕捉されることを保証する写真四肢の両側と内側側面、。

2.筋肉内注射モーターエンドプレートで

1. マイクロピペットプラーとガラスマイクロピペットを引き出します（プランジャとの傾斜マイクロピペットの使用を推奨します）。解剖顕微鏡の助けを借りて、マイクロピペットの内腔の内径は約0.5mmであるように、ピンセットでマイクロピペットの先端を破ります。
2. 使用されているすべての手術器具は、新たにオートクレーブ処理されていることを確認し、目手術領域で無菌です。
3. フルオロゴールド（蒸留水中5％）でマイクロピペットを埋めます。
4. イソフルオラン（O ₂中4％）で誘導チャンバ内に動物において麻酔をかけるを誘導します。立ち直り反射を確認し、導入室から取り出す前に、その不在を確認してください。ラットの鼻の上にノーズコーンを固定し、麻酔の維持のためにイソフルオラン（O ₂中2％）を提供します。動物の足指をつまむ、ゆっくりペダルの撤退と角膜反射の両方が存在しないことを保証するために、動物の眼に触れます。注：ケタミンおよびxylazilの混合物も使用することができる（80および10mg / kgでそれぞれ、腹腔内送達）。ケタミンは、スケジュール8（「制御」）は、薬物とに接着する必要があります薬の購入、使用、保管、廃棄に関連する必要なプロトコルです。
5. 手順の過程で目の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用します。
6. Tを剃りますargeted手足三クロルヘキシジンの交互スクラブと70％のアルコールで剃毛面積を拭くためにガーゼを使用。手術領域に動物を転送します。
7. きれいなアンダーパッドに動物を置き、目標と筋肉（複数可）への良好なアクセスを確保するために適切に配​​置します。
8. 離れて下にある筋肉組織からの標的筋肉上の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで皮膚を切開を行うために、歯のグリップをピンセットを使用してください。切開部が完全に興味のある筋肉（複数可）を露出するのに十分な大きさであることを確認してください。筋膜の中断を最小限に抑えがあることを確認します。
9. 精神的に筋肉（複数可）にMEP領域の位置と形状を転置するMEPの写真を使用してください。
   注：ファインフェルトマーカーは、目的の筋肉（複数可）に写真からMEP地域を再生するために支援することができます。
10. 各s 1-2μLの3〜4回の注射、フルオロ金（MEP領域の全長に沿って複数回の注射を行いますhould）十分です。静かに任意の漏出を除去するために、筋肉（複数可）を拭きます。
11. 鈍鉗子で互いに近接切開皮膚の両端を持って、外科手術用クリップで傷口を閉じます。傷の全スパンに沿って0.1ミリリットルブピバカイン（水中0.5％）（または他の局所麻酔薬）を潜入。
12. それは完全に麻酔から回復されるまで、麻酔器の電源をオフにして、動物を監視します。
13. 筋肉内注射の投与や動物の灌流の間に14日間待ってください。

3.潅流

1. 腹腔内注射によって動物に、ペントバルビトンナトリウム溶液の致死量（150 mgの/ kgの例えば Lethabarb）を管理します。
   1. ペダルの撤退と角膜反射の欠如によって確認されるように、麻酔の深いレベルは、到達するまで密接に動物を監視します。
2. perfusio上に配置された解剖ボード上の背中に動物を置きnは沈みます。
3. 胸骨の基部を覆っている皮膚を持ち上げるために、歯のグリップをピンセットを使用してください。すぐに胸骨下の強い手術用ハサミで小さな皮膚切開を行い、その後、グリップに胸骨の剣状突起軟骨をピンセットを使用しています。剣状軟骨を保持しながら、胸骨から脇の下に、胸腔の両側に切開を拡大します。
4. 心臓を露出させるために、振動板をカットします。
   1. 血液の凝固を防ぐために、直接心臓の頂点にヘパリンの0.mlを注入します。
   2. 左心室へのカニューレの挿入を可能にするために頂部を切断し、その後速やかに止血を用いて適所にカニューレをクランプ。
   3. 細かいハサミで右心房の切開を行い、すぐに蠕動ポンプを起動します。心房から流出する液体が血液のほぼ自由であり、肝臓の色は淡褐色になるまで、0.1M PBで灌流。そして、ソルと灌流動物の体全体まで、パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の化は、剛性になります。

4.頸髄解剖と組織学のための準備

1. その腹部に動物の死体を置きます。
2. メスで身体の正中線の皮膚をカットし、腸骨のレベルに頭蓋底からそれを反映しています。
3. カットスルーと脊柱の背側面を露出させるために傍脊柱筋を反映しています。
4. アトラス、第二頚椎のセグメント（ すなわち 、C2）の骨棘突起を特定し、対応する基礎となる後根を見つけるために、外科用鉗子やピンセットでそれを削除します。
   1. 永久フェルトマーカーでそれを着色し、右C2のルートを特定します。
   2. 1によって次の椎骨1つを削除して、色を交互に右後根をマーク（ すなわち 、C2、C4、C6、及びC8は、緑とC3に着色することができる、C5、C7、T1はCOLすることができます青で）論理和。
5. 静かに脊髄の下端を覆う硬膜を貫通する小手術針（ 例えば 、30 Gゲージ針）を使用します。縦スリットを作るために吻方針を移動させながら上向きに針のベベルで、コードから離れて硬膜を持ち上げます。
   1. 硬膜を反映しています。
6. 新しいメスの刃で1つまたは2つのセグメントブロックに脊髄横断をカットします。
   1. 慎重に隣接する二つの根の間のメスの刃途中で各ブロックの左側に小さな基準マークを作る、ブロックごとに、その場での脊髄セグメントのままにしておきます。基準マークは、ブロックの腹側面から見えるようにするように組織を通る十分な深さであることを確認してください。解剖後の組織セグメントの向きを支援するために、動物の解剖学的構造に関していずれか前方または後方に向い、約45°の角度で基準マークを作成します。
7. パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の溶液を含む小さな、明確に表示ボトルに、個々のブロックを収集し、RT O / Nで残します。
8. ショ糖（0.1 M PB中30％）の溶液を含むクリーン、明確に表示ボトルにブロックを転送し、少なくとも2日間4℃で維持。
9. クライオ金型内のセグメントを配置し、組織凍結培地でそれらをカバーしました。縦組織学的調製のために、上向きに背側面でブロックを配向させ、低温金型内のブロックを配向させるために基準マークを使用しています。
10. -20℃の低温金型を凍結し、50ミクロンの厚さの切片に低温保持装置で切断しました。注：セクションに直接接着顕微鏡スライド上にマウントし、O / Nを乾燥させるために残すことができます。代替的に、切片を0.1 M PBで満たさ48ウェルプレートに浮遊することができ、その後、スライド上の組織切片を配向する基準マークを使用してマウント。

5.腰椎共同RD解剖と組織学のための準備

1. それは背中に動物の死体を置きます。
2. 動物の腹部に沿って正中切開を行い、内臓を取り除きます。脊柱の腹側面を露出させるために後部腹壁の筋肉を解剖。
3. T13前根が骨を出る短い尾最リブとその隣接するT13の椎骨の位置を確認します。
   1. 連続して腹側コードの腹側面のエントリのその時点までのT13腹ルートを追跡するために、微細手術用骨鉗子でT13（ すなわち 、T12、T11と、必要に応じて、T10）に一つずつ二、三の椎骨吻側を削除し、永久フェルトマーカーでマークします。
   2. この時点から、色を交互にして着色、L1、L2、L3、L4、L5、L6およびS1用前根のエントリポイントの位置を特定するために同じ手順を繰り返します。
4. LUMについては、セクション4.5から4.10に記載したのと同じ手順に従ってください脊髄切開をバー。

結果

アセチルコリンエステラーゼ組織化学的染色は、筋肉の幅にわたってモータのエンドプレートの位置を明らかにした。 図1は、全体のラットの前肢で行わかかる染色の結果を示します。これは、硫化アンモニウム溶液の濃度を最適化するために提案されている（ 例えば 、5〜7％の代わりに10％）だけでなく、試料を溶液中に浸漬する時間としては、筋肉繊維上の非特異的バ...

ディスカッション

神経筋条件の実験的治療のための筋肉内ターゲティングおよび対応するα運動ニューロンへの治療導入遺伝子のその後の逆行性伝達は、新戦略ではありません。例えば、この送達方法は、SOD1マウスおよびラット^1,9-12ならびにSMA ¹³とマウスにおいてALS進行の異なる段階での神経筋変性を遅延させるために使用されてきました。有望一方、これらの遺伝子治療のシナリオの有効性...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%