原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

要約

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

要約

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

概要

原子間力顕微鏡（AFM）は、非常に鋭い先端を有するカンチレバー¹を用いて、試料の領域を横切って走査することにより、表面の画像を生成します。カンチレバーの動きは、試料の表面形状をプローブ。液体^2-5に空気やネイティブに近い状態で固定したサンプルを分析することで、その汎用性のために、タンパク質、DNA、および膜を含む- AFMは、広く生体分子に適用されています。

別にナノメートルの範囲内の高解像度の撮像能力から、AFMカンチレバーは、相互作用力（粘着力と反発力）と、試料^5,6の機械的特性を調べるために、ばねとして作用します。これは、力分光法として知られています。このモードでは、プローブは、最初のサンプルに近づき、それに力を及ぼし、それはサンプル（ 図1A）との接触を失うまで、後退します。生成された曲線は、アプリの両方のためのカンチレバーの距離の関数としての力を見せますゴキブリと後退。弾性率を含むいくつかの特性は、材料の硬さを測定し、そして接着力を導出することができます。

サポートされている脂質二重層は、固体支持体の上に横たわっている生体モデル膜である-通常マイカ、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス、またはシリコン^7を酸化しました。これらは、小胞の沈着、ラングミュア-ブロジェット法及びスピンコーティング^8,9のような様々な技術を用いて調製されます。 AFMイメージングは、これらのサポートされている二重層¹⁰の形成は、次のとおりと異なる組成物^11〜15の膜によって形成された異なる構造を探査するために使用されています。

アプローチ曲線のピークに支持された二分子層​​の結果に力分光法を行います。このピークは、二重層を貫通するのに必要な力を示しており、画期的な力と呼ばれています。二重層の厚さはまた、力曲線^6を用いて測定することができます。二重層の代表的な画期的な力NN ⁶ 1-50の範囲。これらの特性は、脂質充填（液体またはゲル相）と構造（アシル鎖長及び不飽和度）に依存し、膜活性剤¹⁶によって変更します。破裂の背後にある理論は^、17を説明したが、そのようなカンチレバー柔らかさ、先端半径と接近速度などの他の実験パラメータも画期的な力^15,16,18に影響^を与えます。力分光法は、膜²¹の安定性に、異なる脂質相^11,19、ペプチドのような組成的変化^12,20、ならびに他の生体分子の効果の特性を分析するために使用されてきました。

サポートされている二重層のオリエンテーションフラットは、より良い構造および膜の性質を特徴づけるために、表面プラズモン共鳴、蛍光顕微鏡²²と^11,19等の他の方法でAFMを組み合わせるために有利で ​​す。

この詳細なビデオプロトCOLは、小胞の沈着を使用してサポート脂質二重層を調製し、AFMおよび力分光法を用いてそれらを分析することを意図しています。様々なサイズの小胞は、二重層を調製するために使用することができるが、このプロトコルは、小規模および大単層ベシクルに焦点を当てています。相が液体注文（L _0）と液体無秩序（L _d）が相に分離支持された二分子層は^11,15を特徴づけました。 2：1の比率で膜を2にジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、スフィンゴミエリン（SM）、およびコレステロール（Cholで）から構成されています。この組成物モデルタンパク質輸送および選別、細胞シグナリングおよびその他の細胞プロセス^23,24のための重要なプラットフォームとして動作するように提案されている脂質ラフト、。

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プロトコル

サポートされている脂質二重層の調製^{（SLB）11,12,21}

1. 脂質混合物および多層ベシクル懸濁液の調製
   1. 事前に以下の緩衝液を準備します。
      1. 2.7ミリモルのKClの濃度でPBS緩衝液を調製し、1.5mMのKH ₂ PO _4、8ミリモルのNa ₂ HPO _4、及び137mMの塩化ナトリウム、pHは7.2。
      2. 150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHが7.4の濃度で、SLB（サポートされている脂質二重層）バッファを準備します。
      3. 1 MのCaCl ₂の溶液を調製します。
   2. 所望の濃度でクロロホルム中、次の脂質を溶解：例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）25 mg / mlの、スフィンゴミエリン（SM）で25 mg / mlのコレステロールで（チョル）に10mg / mlで。
   3. 2：1 DOPC：SM：Cholをモル比2の総脂質1mgので溶液を作るためDOPCの18.38μL、SMとのChol 11.30μlに17.10μLを取ります。 conceに基づいて、それに応じてボリュームを変化させます1.1.2で調製した脂質のntrations。 2：1 DOPC：SM：Cholを、膜²⁵の位相特性を変化さモル比の変更などが、2のモル比を維持しています。
   4. ボルテックスで完全に溶液を混合。一つは、蛍光顕微鏡によって二重層を可視化することを望む場合、0.05モル％の蛍光脂質色素を加えます。
      注：長鎖dialkylcarbocyaninesのファミリーを行ったように、DIOとのDiIは波長の広い範囲に及ぶ、理想的には脂質膜を標識するために使用することができます。あるいは、ローダミンホスファチジルエタノールアミンまたはBODIPYコレステロールのような蛍光標識脂質を使用することができます。いずれの場合も、色素の濃度は、脂質に結合した蛍光体の高濃度は、脂質の挙動^19を変更できることを念頭に置いて、顕微鏡の設定に応じて最適化する必要があります。
   5. N ₂ガ ​​ス（または例えばArやHeなどの使用可能な任意の不活性ガス）を使用して、クロロホルムをオフに乾燥させます。
   6. さらにドライT彼は、少なくとも1時間真空下で混合物を脂質を含みます。
      注：この脂質混合物を保存する場合は、不活性ガスで（N _2、ArやHeを）空気をパージし、-20℃で保存します。小さな茶色のバイアル中に過剰の脂質·イン·クロロホルムを等分。 -20℃で不活性ガスを（N _2、ArやHe）の、店舗の空気を置換する、脂質混合物と同様にして乾燥させます。
   7. 10 mg / mlの濃度にPBS緩衝液中で乾燥した脂質を溶解します。
   8. ボルテックス1分に約20秒間激しく混合物は、多層小胞を含む、濁った懸濁液を取得します。バイアルの側面に付着しない脂質膜がないことを確認します。
   9. 10μlのアリコート（脂質1mgの10アリコートを作る）にこの懸濁液を配布します。
   10. さらに使用するまで-20℃で保管してください。
2. 単層小胞の調製
   注：単層小胞のサイズは、様々な超音波処理法、押出法を用いて調製することができます。超音波処理は、Sを使用していますoundエネルギー混合物を攪拌し、多層懸濁液の層を分離します。これは濁った懸濁液の片付けで示されています。押出しは明確な孔径のメンブレンフィルターを通過する多重膜小胞を強制します。
   1. 超音波処理法
      1. 多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。
      2. （2ミリリットル）小さなキャップされたガラスバイアルに混合物を移し、パラフィルムで密封します。
      3. 10分間、またはそれは小さな単層小胞（直径50 nm以下のSUV車を）得て透明になるまで浴ソニケーター中で室温で混合物を超音波処理。
   2. 押出法
      1. 多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。
      2. 極低温チューブに懸濁液を移します。
      3. 液体窒素中で数秒間低温管を浸漬することによって脂質懸濁液をフリーズします。
      4. 解凍数分間室温または37℃の水浴中で極低温管を浸すことにより、脂質懸濁液。凍結融解工程を少なくとも10回繰り返します。
      5. 脂質懸濁液を押し出すために、200 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を使用して、商業的押出装置^26（他の孔のサイズは、100ナノメートルまたは400ナノメートルのような利用可能です）。
         注：現在、2押出機の装置は市販さがあります：マニュアル押出機は、少量（数mlに200μl）を利用可能です。この場合、サンプルは、手動で2つのシリンジ間で前後にサスペンションを押して、膜を通って押し出されます。製造業者によっては、脂質のアリコートをセットアップの最小体積に到達するために結合される必要があります。大きなボリュームの場合（最大50 ml）を、より洗練されたデバイスが使用される懸濁液は、圧縮ガスを用いてポリカーボネート膜を通して押し出されます。セットアップおよび押出条件は、MODに応じて変更することができますエル。使用前にメーカーの説明書を参照してください。このプロトコルは、小容量の手動押出機を指します。
      6. 押出機に水を通過させることにより、水中の押出機を平衡化。水に膜を浸します。
      7. 2ピストン間の膜を配置し、装置を組み立て、一方のシリンジから他に、押出機を介してバッファを通過させることにより、バッファに平衡化。このステップは、さらに、システムの漏れやすさをテストすることができます。それが漏れた場合は、メンブレンを変えるそれを再度分解して組み立て直します。
      8. 押出機（ '汚い'側）のいずれかの注射器を使用して、脂質懸濁液を取ります。
      9. 1室と対向室に空の注射器の脂質懸濁液を含む注射器を取り付けます。
      10. 一方の端部に注射器を押してください。膜を介して対向シリンジにソリューションを渡します。これは、1 ^回目のパスです。
      11. このような31回の合計のための膜を通って、それを渡します解決策は、対向するシリンジ（「クリーンサイド」）で終わること。
          注：押出成形した後、膜を確認してください。それが壊れていた場合には、押出プロセスは成功しなかったと繰り返される必要があります。
      12. 小さなチューブに注射器を空にします。大型単層小胞（LUVを）は4℃に維持した場合に1〜2日間安定です。
3. マイカとカバーガラスの作製
   1. 洗浄は、最初に水で、次いでエタノール中でカバースリップ。空気乾燥。
   2. マイカディスクを取り、粘着テープを使用して、外側の層を剥がします。
   3. カバーガラス上にマイカディスクを取り付けます。一つは蛍光顕微鏡で二重層を確認できるように透明な光学接着剤が最適です。
   4. 光学接着剤/グリースを使用したプラスチック製のシリンダーインチ（2.5cm、外径、2センチメートル内径、及び0.5センチ高さ）を取り付けます。すべてが封入されていることと、漏れがないことを確認します。それらは容易に目から取り外すことができるように、シリンダを再利用したいときにグリースを使用Eのカバーガラスと洗浄。プラスチックシリンダーの寸法は、AFMのカンチレバーホルダーの大きさに依存し、それに応じて調整されるべきです。
4. 固体支持体上の単層小胞の沈着
   1. ピペットでマイカ上に直接全体リポソーム溶液。 300μLの体積に到達するために、よりSLBバッファを追加します。
   2. 3ミリモルのCa ²⁺の最終濃度に達するように1 M塩化カルシウム溶液の0.9μLを加えます。
   3. 少なくとも10分間、2分間37℃でインキュベートし、次いで65℃で。常に緩衝液で二重層をカバーしています。空気と気泡との接触は、それを破壊します。必要に応じてインキュベーションの間に、より高い温度でインキュベートする場合は特に、より多くのバッファを追加します。
      注：インキュベーション温度は、必要な脂質混合物との相に応じて変化します。少なくとも10分間のインキュベーション時間が支持された二分子層​​を形成するために必要とされるが、それは、温度及び組成に応じて、長くなる可能性があります。
   4. ウォッシュカルシウムと融合していない小胞を除去するためのホット（65°C）SLBバッファーで二重層15-20回。バッファの下に二重層を維持するために、洗浄工程の間に特別な注意を取り、そっと二重層を壊さないように洗浄溶液をピペット。
   5. AFM測定前に室温に支持された二分子層​​を冷却します。これは、膜の異なる相を形成するだけでなく、機器の熱ドリフトを最小化するために必要とされます。

2.原子間力顕微鏡の測定^11,12

1. イメージング
   注意：接触モードまたはタッピングモードで原子間力顕微鏡イメージングを実行します。溶液中の画像支持された二分子層​​;これが二重層を破壊するように溶液が完全に蒸発することはできません。一つは、バッファで作業されるように、任意のAFM部が液体流出から保護されていることを確認することで安全上の注意事項を守ってください。
   1. 柔らかいカンチレバーを選択します（N 0.2以下/ m個のばね定数をお勧めします）とtにマウント彼AFM。カンチレバー剛性の選択は、力分光法のためのより重要である（これについては後述します）。
   2. AFMステージにサンプルをマウントし、すべての振動分離モジュールがオンになっていることを確認してください。平衡化し、システムの熱ドリフトを低減するために、少なくとも15分間待ちます。 AFMのセットアップに応じて、チューニングおよびイメージング仕様が異なる場合があります。メーカーのハンドブックを参照してください。
   3. 接触するまで、AFMチップを試料にアプローチ。
   4. 脂質二重層は、通常、高さが4 nmであるため、最高のz解像度（例えば1.5μm）を与える器具のZ範囲を使用しています。
   5. 画像の領域を選択します。脂質二重層の概要を取得するには、50ミクロン×50ミクロンまたは25ミクロン×25​​ミクロンの領域は、画像への良い出発点になります。小さい特徴が表示された場合は、小さな領域内の1つの缶の画像（10ミクロン×10ミクロン、または2ミクロン×2ミクロン）。撮像領域の選択は、作業rに依存します圧電スキャナのアンジュ。このため、機器のマニュアルを参照してください。
   6. 二重層は非常に壊れやすいように、試料との接触を維持しながら、熱ドリフトを最小限にし、正しい力を維持するために撮像中にAFMチップのセットポイントを調整します。接触モードでは、設定値を最小にします。タッピングモードでは、設定値を最大化します。
   7. 多項式レベリング機能への各走査線に当てはめることにより、プロセスイメージ。 AFM製造会社の独自のソフトウェアを使用して膜との接触を失うスキャンの行の削除を実行します。
2. フォーススペクトロスコピー
   1. 製造業者のプロトコルに従って指示に従って、カンチレバーを校正。キャリブレーションは、フォトダイオードの電気信号の変換は（ 図1B）を強制することができます。
      1. ボルトのZピエゾ（長さの単位）の移動の代わりに電気信号としてたわみを測定するために、先端の感度を調整します。
         注：AFMは、カンチレバーの背面で反射されたレーザを用いて、カンチレバーのたわみの変化を検出します。レーザは、空間的にレーザスポットの位置を検出することができるフォトダイオードに達します。それは、サンプルとの接触時に曲がるようにカンチレバーのたわみの変化は、「垂直偏向」としてこのフォトダイオードによって検出され、これは電圧の単位です。カンチレバーは、Zピエゾによって移動されるので、垂直偏向をzピエゾの動きに関連しています。垂直偏向およびZ移動の間の比率は、感度と呼ばれ、距離に電圧を変換します。
      2. 通常、AFMソフトウェアに組み込まれた熱雑音周波数法を用いてカンチレバーのバネ定数を計算します。この方法では、パワースペクトル密度のプロットを作成する、発振周波数に対するノイズの振動の振幅をプロットします。このプロットは、共振周波数付近のピークが表示されます。周波数、振幅I最大の共振周波数であるです。自動的にソフトウェアによってバネ定数を計算するために、ピークの周りにローレンツ関数を取り付けます。熱雑音の方法論のためにいくつかの有用なリソースを参照^27-30に示されています。
   2. 二層の領域を画像化した後、力分光法を実行するために二層に5ミクロン×5ミクロン領域を選択します。
   3. それは、その領域の16×16のグリッドに力曲線となるように、AFMを設定します。これは、地域ごとに256の力曲線になります。隣接する二つの点の間の空間は、1ポイントプローブさの膜面積は次のポイントと一致することを回避するのに十分であるべきです。これは、先端半径に依存しています。 2点間の100 nmの距離が理想的であろう。 16×16のグリッドに5ミクロン×5ミクロンの領域に分割します。相の大きさに応じて、1つは、より小さなまたは大きな領域を選択し、それに応じてグリッドサイズを調整することができます。
   4. に設定し、Zピエゾ変位400 nmの。これは、zピエゾの最大移動範囲を決定します。それは、カンチレバーが完全に測定値間にサンプルから離れて後退していることを確認してくださいするのに十分な大きさでなければなりません。
   5. 800 nmの/秒にアプローチ速度を設定し、200 nmの/秒の速度を撤回。二層組成物及び^6,16を検討する脂質相に応じて400〜6,000 nmの/秒の間の接近速度を使用します。
   6. すべてのパラメータを設定した後、AFMソフトウェアの「実行」ボタンを押すことによって、力曲線を取得します。
   7. 高さ曲線（Zピエゾの動きの測定値）対力として力曲線を保存します。これは、アカウントにするとき、試料と接触しているカンチレバーの曲がりを取ることはありません。データ処理ステップの間、AFMソフトウェアは、二層の厚さのために適切な値を与えるチップと試料の分離曲線（ 図1C）、対力を得るために曲げカンチレバーの補正を可能にします。補正値は、通常calibrに組み込まれています各力曲線と一緒に保存されているエーション、。ある時点で、ピエゾ動きから垂直偏向を減算することにより、先端と試料との分離を計算します。
      注：アプローチ力​​曲線のピークは（カンチレバーの動きがアプローチサイクルに残っている場合でも、力の値がダウンする）膜の画期的な力である、このピークの位置と点の位置との差ながら、力が再び上昇し始めるところ、膜の厚さを提供します。
   8. 良好な統計情報を取得する条件ごとに、少なくとも500の力曲線を取得します。起源か、MATLABなどのプログラムを使用して値のヒストグラムをプロットし、分布のピークと幅を取得するためにガウス分布にヒストグラムをフィット。

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結果

DOPCからなるサポートされている脂質二重層：SM：チョル（2：2：1）AFMで画像化した（ 図2 AC）。ための脂質組成物、SM / CholをリッチL _oおよび DOPCリッチL d _の相が観察されました。 AFM画像から高さプロファイルは、膜構造に関する重要な情報を提供することができます。高さプロファイルを見ることによって、二層の厚さを提供することができる膜（ 図2B）?...

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ディスカッション

DOPCから成るのSLB：SM：Cholを（2：2：1）塩化カルシウムにより誘導される小胞の吸着および破裂後雲母上に形成されました。この脂質組成物は、L _dとLの_O相に分離しました。 Lの_O相は、スフィンゴミエリンとコレステロールに富むとL _D相 ¹¹未満の流体/より粘性（ 図1A）です。 Lの_D相からL _Oの分離は、周囲（ 図1B、C）<...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200