別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

要約

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

要約

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

概要

除草剤はグローバル植物保護市場¹の最大50％を占め、雑草防除対策を最も広く使用されています。彼らは労働集約的で時間のかかる土壌栽培慣行を回避するには、比較的安価なツールであり、最終的に費用対効果の高い、安全かつ収益性の高い食糧生産²をもたらします。しかし、一緒に除草剤の使用上の過度の依存を持つ多くの雑草種に大きな生物季節と遺伝的変異の存在は、しばしば除草剤抵抗性雑草集団の選択をもたらします。非常に特定の代謝ターゲット^3-5と選択性除草剤の導入が飛躍的に年間で抵抗症例数が増加しています。現在までに、世界中の240雑草種（140双子葉植物と単子葉植物は100）アクション^（SOA）4の異なる除草剤サイトに対する抵抗性を進化させてきました。これは、持続可能な作物生産のための雑草管理と一般的に多くのための主要な関心事です。

頻繁に温室で行う信頼性試験、に基づいてe_content ">抵抗の早期検出は、除草剤抵抗性雑草を管理するための重要なステップである。別のアプローチがよう、目的、精度、時間と利用可能なリソースの要求レベルに応じて開発されていますよく^6-12を考え雑草種とし ​​て。しかし、新しい雑草バイオタイプの抵抗状態の確認が（必要とされる場合、すなわち、に属する1つまたは複数の除草剤に耐える能力を含むいくつかの生理学的特性を共有する個人のグループ、通常、それらを制御することになる用量で使用される特定の基）、強固な全植物バイオアッセイは、制御された環境^4、11で実行される必要があります。

バイオタイプはただ1つの除草剤に耐性めったにあります。各生物型は、従って、一定の抵抗パターンを特徴とする、除草剤、SOAの、すなわち、数と種類は、それは、与えられた抵抗によってに耐性であります各除草剤¹³のレベル。クロスまたは複数の抵抗⁵のパターンの早期かつ信頼性の高い決意^、14は、圃場抵抗性管理のために重要です。

それは、その除草剤抵抗性は自然寛容とは何の関係もない言及する価値があるいくつかの除草剤、 例えば、ACCアーゼ阻害除草剤、単子葉植物種対2,4-D対双子葉植物種、 スギナarvense対に向けていくつかの雑草種の展示グリホサート。

本稿では、除草剤（複数可）によって制御不良が報告されていた分野でサンプリング推定される除草剤抵抗性生物型をテストするための堅牢なアプローチを提示します。関連する雑草種に関連する標準的なプロトコルに関連する変異体が提示されています。唯一の除草剤の投与量^15を使用して全植物バイオアッセイのいずれかに基づいて、代替技術/プロトコル経由での利点、または^8が高いreliabに関連しているペトリ皿に種子を処理しますilityとための実験における2つの除草剤の投与量を含めることの抵抗レベルを推定する可能性。しかし、ルーチン抵抗試験のため、同一の方法がそのようにコストを削減し、唯一の除草剤用量で適用することができます。

同様に、抵抗状態の確認を可能にするように、得られた情報は、両方の研究は、以下の工程を最適化し、および/または音響抵抗管理戦略を考案するために使用することができます。

プロトコル

1.種子採取と保管

1. 不利な気候条件や低品質の除草剤処理に起因するものではない不当な貧弱な除草剤の性能のための耕地、 すなわち、監視します。
2. 一度に一つの種からの種子のサンプルを収集し、一意のコードを割り当てます。成熟した種子は、通常、除草剤処理（複数可）を生き残った植物から作物の収穫前に収集されます。ときに成熟した種子は母植物により流されているかどうかを観察するためのタイムリーなモニター。
3. 種、収集日、GPS座標、市町村、農業者の名前、フィールドのサイズ、蔓延レベル、作物、除草剤（複数可）シーズン中に使用すると、フィールドの歴史的な記録の割り当てられた固有のコード、名前を示す各サンプルのフォームに記入。
4. フィールドの侵入を代表するものであり、少なくとも30ランダムに選択された植物からの種子を収集します。種子サンプルは、少なくとも5,000成熟種子が含まれていることを確認してください。絶対異系交雑雑草種のための（ 例えば、ライグラス属やアマランサス属 ）、5,000 ¹¹周りの種子の総数を維持し、10〜15に植物の数を減らします。
5. 別の除草剤抵抗性生物型が選択されているように雑草のパッチが大面積（ヘクタール以上）に散在している場合は、フィールドをサブサンプル。
6. 割り当てられた固有のコードで標識された密閉されていない紙袋で種子を保管してください。
7. 水分を蒸発させるが、二次休眠の誘導を回避するために高温に（ すなわち、太陽の下で車の中でそれらを残さない）、または極端な温度変動に種子が公開されていません。
8. （籾殻、デ船体の種子などを削除）し、乾燥室で、周囲温度で保管してくださいきれいな。第1の抵抗のテストを行った後、真空封止されたプラスチック袋であることが好ましく、4℃で暗い部屋で長時間の種を保存します。このようにして、種子はかなり長い時間のために彼らの生存能力を維持します。

2。種子休眠覚醒

注：種子の休眠は、農業生態系に適応し、永続化するために雑草を可能にする、柔軟で効率的なメカニズムを提供します。休眠を打破し、種子の発芽を可能にするために、異なるプロトコルは雑草種、 すなわち、休眠¹⁶の種類に応じて使用する必要があります。
休眠を削除するには、3つの主な方法があります。

1. 春化
   注：同時発芽と実生発生を取得するには、数日から一週間の範囲の種子春化の期間は、多くの種からの生理的休眠を除去する必要がある：例えば、アオゲイトウ 、 シロザ 、 ライグラス属、カラスムギ、タデタデ属、Phalarisは ^17-19を paradoxa。最大15日間の長い期間がSchoenoplectus mucronatusのために30日までヒナゲシ 、 タマガヤツリとAmmaniaのcoccineaのために必要とされています 20。
   1. プラスチック皿にいくつかの脱イオン水を入れてください。ろ紙の二つの層をカットし、水に浸し、余分なを削除します。紙の上で空気乾燥させた種子を置きます。時間の必要な期間、4℃で冷蔵庫にプラスチック皿を転送します。
2. 乱切
   注：一部の雑草種は、機械的休眠、 すなわち種皮特性に他のものより発芽に対してより難治であり^、21を発芽さ硫酸を用いて化学乱切の使用を必要とします。
   1. 濃硫酸（95から98パーセント）を入れたビーカーを準備します。一杯の水ビーカーを準備します。不織布の袋に種子を入れてください。
   2. 濃硫酸に、それぞれ、20分または5分間例えば、ノビエ。またはソルガムhalepense種子を浸します。
   3. ピンセットを用いて、ビーカーから封筒を取り出し、水を完全にビーカーに入れます。開きます封筒、小ザルに種子を入れ、流水でそれらを徹底的にすすぎます。
   バリアント：A.オオバコ·アクアティカは、異なるプロトコルを必要とする^22、23
   1. クロロホルムで2分間の種子を浸します。脱イオン水で種子をすすぎ、吸収紙でそれらを乾燥させます。 5分間、80％硫酸中で種子をダンク。
   2. 小ザルに種子を入れ、十分に流水でそれらをすすぎます。
3. 収穫後の種子成熟
   注：他の雑草種の種子は関係なく、休眠を打破するために使用される方法の、成熟した後、数ヶ月のために全く発芽しないでください。
   1. RTおよび低湿度で少なくとも3〜4ヶ月の期間のための種子を保存した後、休眠打破（ 例えば、オリザサティバのVAR。sylvaticaまたはP. rhoeas）については、上記のプロトコルに従ってください。

3.種子発芽

1. PLASで発芽する種子を置き、0.6％を含むチック皿0.1％の硝酸カリウムと（M / V）、寒天（KNO _3）を添加しました。
   1. 脱イオン水を用いて0.6％+ 0.1％のKNO ₃の寒天の溶液を調製します。電子レンジで寒天を溶解します。
   2. プラスチック皿に寒天溶液を注ぎます。基板を冷却した後、種子に入れます。
   バリアント：土壌をプラスチック皿に基質としても使用することができます。この方法は、 ノビエのために特に効率的です。、S. halepenseとライグラス属 。
2. 各雑草種の最適条件に応じて、光と温度条件で約一週間発芽キャビネットにプラスチック製の皿を置きます。ほとんどの冬の種について、温度範囲は15/25℃の夜/日と15〜30マイクロモルのM ^-2秒^-1の光合成光量子束密度（PPFD）を提供するネオン管で12時間の光周期です。多くの夏の種については、温度範囲は15/30℃の夜/日です。
   バリアント：S例えばS.などOME種、 halepense、熱処理を必要としています。したがって乱切後、Sの種子45℃で4時間のサイクルと20時間24℃で発芽キャビネットで3日間、その後通常の状態で三日：halepenseは、以下の条件に供されます。

4.苗の移植と成長

1. 移植標準ポッティングミックスを充填したプラスチック製のトレイ（325 X 265 X 95ミリメートル）に十五から二十苗（60％シルト質壌土、15％の砂、15％agriperliteと10％の泥炭 - 体積）。
   注：移植は、代わりに直接播種、除草剤処理の性能を最適化するために重要な前提条件である、同じ成長段階における植物の均一なスタンドを得ることができます。
2. 数プログレッシブトレイ番号を複製、人口コード、除草剤が試験されている<：固有の識別のためのすべての情報を含むバーコードと、各トレイを識別します。/ LI>
3. フィールド容量またはその付近に基板を維持するために必要に応じて加熱された温室効果、水、植物に入れトレイ。
   注：成長温度は雑草種に依存して変化します。多くの場合、テストは秋/冬/春の間に行われているので、光は約150マイクロモルのM ^-2秒^-1および12時間の光周期^24、19のPPFDを提供400 Wのメタルハライドランプを使用して補充される。夏の雑草種でC ₄光合成サイクルは、通常、より高い光強度を必要とするため、試験は後期の春夏または補充した光強度で行われ、約400マイクロモルのM ^-2秒^-1 14時間の光周期です。
4. 水稲に寄生いくつかの雑草種のための異なるプロトコルを使用して、 例えば、A。オオバコ·アクアティカ、S. mucronatusとC. ²²で説明したようにdifformis。
   1. 24ラウンドの細胞（55ミリメートルの直径、深64ミリメートル）FILとポリスチレントレイに苗を移植60％シルト質壌土、30％の砂と（体積比）の10％ピートと導きました。
   2. 12センチメートルでトレイ深いプラスチック容器を水で満たし、彼らが（ 図1）をフローティング防止するために、ネジ止めのステンレス鋼棒によりダウンbattenedを設定します。
   3. 土壌表面のレベル以下の1〜2センチメートルで容器内の水位を維持し、藻類の増殖を回避するために、（水の10〜12 Lを含む）の各コンテナに硫酸銅1.5gを追加します。

5.の除草剤処理

1. 発芽前除草剤との処置：
   1. 第3章で説明したように発芽キャビネット内の約3日後に、上述の基板を含むプラスチックトレイに発芽種子を移植し、土壌の層（約1cm）でカバー。これは、苗は、除草剤の効果ではなく、過度の埋没深さに起因して出現しないことを確実にするために重要なステップです。
   2. フィールドCAPAに基板を取ります水の入った皿の上に、下部にいくつかの穴を有するトレイを配置することで都市。
   3. 発芽前除草剤²⁵でトレイを治療、移植後のある日。
   4. 受け皿から毛細管現象により上方および下方の両方から、必要に応じて水を添加しての基板または近接場の容量にしてください。この手順では、良好な治療効果のために（ すなわち、発芽種子がどこにあるか）適切な深さでの除草剤の耐久性に有利に働きます。
2. 発芽後の除草剤との処置：
   1. 彼らは2-3葉期に達したときに植物をスプレー（ すなわち、成長段階拡張BBCH成長スケール²⁶の12〜13）。
   2. 治療後の日から開始し、 ノビエのために、例えば （雑草種や季節の水の要件に応じて灌漑システムを設定します。それが3分間水を提供して1日4回、定期的な間隔で午前9時から9に午後）。水はDISであります自動スプリンクラー灌漑システムを使用してtributed。
      バリアント：グリホサートは、植物ステージBBCH 14-21で適用されます。
3. 除草剤の準備と配布。
   注：（前および発芽後）すべての除草剤は、2つの用量で推奨界面活性剤と市販の製剤として適用される推奨フィールド用量（1×）および3回（3回）こと。
   1. 必要に応じて、ラベルの指示に従って、バルク中の界面活性剤溶液を調製。最終濃度は、通常、最終的な体積（ 例えば、0.3％）の百分率として、または体積が単位面積（ 例えば、1ヘクタールL ^-1）毎に分散されるように表現されます。
   2. 有効成分の右の濃度を維持するために除草剤（溶質）溶液の溶媒として、界面活性剤溶液を使用してください。最初の最も濃縮除草剤溶液を調製する（3回）。場合、界面活性剤溶液中（または脱イオン水に溶解される商品の数量を計算します界面活性剤は、以下の式を使用して）必要はありません。
      線量_ハーブ = [（投与量_{フィールド} x線量_最大 ）×V _フィン ] / _V·デル
      ここで、用量_ハーブ =除草剤の量（ml）を、用量_{フィールド} =除草フィールド用量（HAミリリットル^-1）、用量_maxは =最大用量送達、V _フィンは =溶液（L）の最終体積は、V _デルはによって送出量を=ベンチ噴霧器（Lヘクタール^-1）。
   3. 希釈（2：1、v / v）の除草剤溶液は、低濃度一方（1×）を調製するために3倍。この手順では、除草剤を計量するか、ピペッティング時にミスを作るチャンスを減少させます。体積が単位面積（Lハ^-1）ごとに配信するように除草剤溶液濃度が表現されます。
   4. 低い除草剤用量（1×）での処理のシーケンスを開始します。このように、同じ除草剤との2つの処置の間に噴霧キャビネットを洗浄する必要はありません。
   5. 除草剤solutioを配布nは215キロパスカルの圧力で、300 Lヘクタール^{-1（±1％）}を配信精密ベンチ噴霧器を使用して、および0.75メートル秒の速度^-1、3フラットファン（拡張範囲）油圧ノズルを装備したブームに。
   6. 除草剤は、漂白剤を1％を使用して変更されたときに二回噴霧キャビネットを洗浄（v / v）で、次いですすぎます。
      バリアント：グリホサート、200 Lヘクタール^{-1 27}の噴霧量で塗布されます。
      注：特に注意は非常に生物学的な除草剤は、例えば、スルホニル尿素のスルホメツロンやフラザスルフロンは、使用された場合に支払われなければなりません。後者の場合、アンモニアと、ワン漂白溶液で洗浄し、別の操作を行い（2.5％v / v）を、水で注意深くリンスしました。

6.データの収集および分析

1. 自動的に各トレイを識別するバーコードリーダーを介して、治療だけでなく、ビジュアル推定バイオマス（VEB）を生き残った植物の数を記録します。植物はお尻です彼らは関係なく、色やその他の外観のアクティブな成長を示していない場合は死んでいるようessed。
   1. 試験された除草剤に応じて3週間または4週間の治療（WAT）の後に評価をする（ 例えば、ACCアーゼ阻害剤のための3つのWATおよびALS阻害剤またはグリホサートのための4つのWAT）。
   2. すなわち感受性集団（Sを確認してください）すべての実験では、決してまたはめったに除草剤で処理されなかったサイトで収集した人口を含めることにより、一般的な治療の有効性を評価します。
   3. 処理された植物の数の割合としてExpressの植物の生存は、（2つの複製の平均値）だけ除草剤処理の前にカウントし、平均値あたりの標準誤差（SE）を計算します。
   4. VEBは、同じ人口²⁵の処理され、処理されていないチェック^、28との間の植物バイオマスを視覚的に比較して得られる。スコアを、除草剤の影響を受けていない植物のための10の範囲（処理されていない検査と比較して）0にいつ植物が明らかに死んでいる、各処理されたトレイに与えられます。
2. S生存者よりも多くの除草剤用量1X、Rで5％〜20％の範囲であったときに、植物の5％未満が、除草剤用量1X、SRを生き延びた二つ除草剤用量で処理から得られた結果に基づいて、4つのカテゴリへの帰属集団生存者は除草剤の用量1倍で20％以上と除草剤の投与量の3倍¹⁷で10％以上である場合には、植物の20％が除草剤の用量1XとRRを生き延びました。

結果

推定上の耐性集団の抵抗状態を評価するためには、除草剤の有効性を確認するためにアッセイにおける感受性の検査を含むことが基本です。 P.で行ったスクリーニング試験の結果rhoeas集団は、小麦畑に寄生雑草は、感受性の検査（09から36）のと疑わ耐性1（10-91）上の4つの発芽後除草剤の有効性が示されている図2に報告されています。人口09から36は、完全に唯一の?...

ディスカッション

1）種子が成熟した除草剤処理（複数可）を生き残った植物から収集する必要がありますプロトコル内のいくつかのステップは、集団における除草剤耐性の成功を評価するために重要です。マザー工場の種子の成熟は、後に種子の発芽における困難を回避することが重要です。 2）種子の適切な保管が発芽を妨げるカビの増殖を回避することをお勧めします。除草剤パッケージのラベルに報告...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro