デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

要約

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

要約

デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。

私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。

我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。

概要

核酸定量化（デジタル^PCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ^5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。

過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。

WGA反応⁶の高収量は、単一分子^7、単セル⁸および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル⁹からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連する主要な課題は、その汚染物質に対する極端な感度、個々のテンプレート分子⁶全体で不均一に増幅しています。 WGAによってWGA技術¹⁰の「キラーアプリケーション」、およびテンプレートの定量化は、アプリケーション⁷の多くの分野で重要であるように、単一のセルの順序が浮上しているようしかし、WGAが人気を集めています。

デジタル核酸定量化のための計測は、以前バルブ付きとバルブレスマイクロ流体フォーマのさまざまに記載されています小滴ベースのアッセイを含むTS ^{11-14、15,16（} 表2）。しかし、デジタル解析用の市販のマイクロ流体システムは、反応のセットアップと製品の検出に特化した¹⁷の機器を必要とします。カスタムバルブ付きマイクロフルイディクスは、柔軟であるが、高精度の微細加工と空気圧制御システム^{18が必要です} 。それは、エマルジ ​​ョンベースのデジタルアッセイ^19,20のために単分散の微小液滴を作ることは比較的簡単であるが、デジタル読み出しは、（人気の次世代配列決定技術に類似）のいずれかの大規模な広視野イメージング^{21,22を必要とする} 、技術的に厄介であるか、または高速フローベースの滴検出^23-25。理想的には、デジタル分析は、複雑な器具類の必要性を低減し、多数のサンプルを迅速に読み出すことができるように、読み出しにセットアップから簡単になります。ここでは、従来のリアルタイムPCR Iを使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を説明しますnstrumentは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定しました。

新しいアプローチは、デジタルPCRアッセイに適用することができるが、それは、（PCRのための優れた結果を与える）問題とリアルタイム増幅アッセイアナログれるデジタルWGAアッセイに特に有利です。 WGAは、一般的に、配列、長さ、及びベース含有量の不均一であるテンプレート分子にサンプルに適用されます。これらの異なる鋳型分子は、整合特性を有する参照（「標準」）のサンプルの使用を必要とする、異なる速度⁶で増幅されています。多くの場合、そのような標準が利用できない、または入ってくるサンプルの特性は不明です。入力された質量、分子の入力番号、2つ、またはいずれの組み合わせを-入力された材料の不均一性及びWGA化学の長さに依存する特性^{26はまた、}定量化されているもので曖昧さを作成することによって、結果の解釈を複雑にします。 F任意の配列の汚染物質の分子が妨害する可能性があるためinally、配列非特異性は、定量的PCRよりも汚染に敏感定量的な複数置換増幅（MDA）をレンダリングします。マイクロ流体デジタルアッセイは、鋳型分子を分離し、より少ない汚染物質がサンプリングされるように、反応体積を減らすことによって、汚染に対処します。

ここでは、人気の等温WGA法、MDA ^{27を使用します} 。注目すべきは、PicoPlexとMALBAC ^28を含むいくつかの他のWGA化学は初期等温鎖置換手順に決定的に依存しています。等温ステップは、定量的WGAするアナログリアルタイムアッセイを適用する挑戦を悪化させます。 WGAは完全に不要な変数プレ増幅につながる、セットアップ中に防止なく、また離散化もできない（「循環」）異種の分子の複製が完了するまで駆動し、PCR前¹¹のように、次のサイクルに停止することができる方法で、 （ 図1）。 WGAのためのデジタルアッセイ形式は、（そのように前増幅は、結果には影響しません）アッセイエンドポイントでの列挙のための各分子の分離に起因する典型的な反応セットアップ手順をaccomodates元の読み出しが精度が増幅効率の変動に大きく依存することになることを意味します。

アッセイエンドポイントでの1滴あたりの信号レベルは液滴量に依存することになるようアッセイは、均一な体積で油中に生成される液滴に依存しており、我々は結果の一貫性は、液滴サイズの分布全体に平均化に依存する必要はありません。単分散液滴を作ることになりました（約​​3,500単分散液滴の論文は2013年以降に発行された）標準的な手順ですが、マイクロ流体計測器^{25を必要とします} 。実際には、以上の6社は、このような液滴の生産に依存している独立した商用製品を開発している、と液滴作りのマイクロ流体チップは、^23,29市販。この研究のために、私たちは内製のカスタムマイクロ流体デバイスを（プロトコルを参照）を使用しました。デバイスを通る流れを駆動するためのシリンジポンプはまた、市販されているが、代替的に、コスト^{を削減する30}真空駆動流のための単一の使い捨て注射器で置換することができます。

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プロトコル

注意：このプロトコルの液滴は、既存の商業用の液滴メーカー^23,29を形成することができるように、マイクロ流体デバイスを製造することは、このアッセイのために必要ではありません。

1.液滴形成マイクロ流体デバイスを作ります

1. 以前に³¹が、液滴発生器のマスクパターン^32と概説SU-8マスター製作プロトコルチャネルのためのマスターモールドを準備します。
2. ソフトリソグラフィ^32,33の技術を使用して、PDMS内のデバイスを製造します。

2.バルク液滴読み出し用の反応ミックスを調製します

注意：このプロトコルは、増幅反応の多くのタイプを使用して、核酸を定量するために使用することができます。一例として、いくつかのラムダDNA濃度のMDAのために必要な試薬が挙げられます。試薬の詳細は特定の試薬の表に記載されています。液滴内のテンプレートの配布はsufficienに依存サンプルのトン混合。

1. 取得またはPurifyのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。
   1. 以前サプライヤーから^7、または購入を説明するようにファージPhi29を精製します。示される実験に使用されるフ​​ァージPhi29を精製しました。
2. 65 mMのKOH、1.65 mMのEDTA、及び14 mMのDTTからなる変性緩衝液10mlを準備します。
3. 65 mMのHClを、0.21 Mトリス-Cl pH7.0の、および9 mMのトリス-Cl pH8.0のからなる中和緩衝液10mlを準備します。
4. このようなヌクレアーゼフリー水のような2つの規格、1テンプレートを含まないコントロール（NTC）、および1つの高鋳型濃度（4 PG周り/μlのラムダDNA）を準備します。定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの各標準の3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLで各クエンチ。
5. 定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの関心のテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。 3.3μlのクエンチ中和バッファーの。
6. 氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2X MDA反応マスター混合物を2×二本鎖DNA（dsDNA）結合色素、2倍のqPCR参照色素、オリゴランダム化50μM、2 mg / mlのBSA、2×ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼを含まない水で構成され、および40 / mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。ファージPhi29 DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼがよく7.5.Mixよりもはるかに高いまたは低いpHレベルが発生しないようするために、最後の追加します。
7. オプション：少ない偽陽性の場合は、事前の液滴^{34を形成する} UV光でマスターミックスを公開します。
   1. 氷上で0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットル明確なチューブにサンプルあたりの予備混合物の10μlのを準備します。プレミックスは、55μMの無作為化オリゴ、2.2 mg / mlのBSA、1.1倍ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー、5.3 mMのdNTP類、およびヌクレアーゼフリー水で構成されています。
   2. ^{34に記載されているように}氷の上に水の中にチューブを置き、ACCUに、UV光（254nm）に公開5.7 J / ^cm 2のmulated用量。
   3. 予備混合物中に40μgの/ mlに二本鎖DNA結合1Xに染料、1Xに参照色素、およびファージPhi29を追加します。よく混ぜます。
8. 変性テンプレートまたは標準10μlのマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。

3.液滴形成

注液滴が静電気やせん断応力に対して非常に敏感であることができます。静電気が発生する可能性があり衣服を削除して、液滴を形成する前に、身体を接地してください。できるだけエマルジョンから、管の上部からエマルジョンのチューブを処理します。非常にゆっくりとピペットエマルジョン、好ましくはワイドボアピペットチップと。ピペットチップから分配する場合には、分注速度を決定するために、先端の側面にエマルションを見ます。

1. フォーム滴。示される実験では、マイクロ流体デバイスは、オイル入口と液滴を生成するためのフローフォーカシングジャンクショ​​ンの2つの水の入口があります。 2シリを使用してくださいNGE 20,000 1 NL液滴を生成するために、マイクロ流体チップを介して界面活性剤と油の55μlの反応混合物の20マイクロリットルの流量を制御するためのポンプ。
2. 注：これは、界面活性剤と油の多くの種類の液滴を生成することが可能であるが、組成物は、非常に高温で、経時安定性、液滴に影響を与えます。一つの可能な組み合わせは、陰イオン界面活性剤^19,35とフッ素系オイルのHFE 7500です。
3. いずれかの方法^13,36との任意のサイズで液滴を生成するが、液滴集団内のサイズの変動は、バルク蛍光ため、アッセイの精度に影響します。示される実験では、液滴は1 NLの量で単分散しました。
4. PCRチューブに液滴とオイルのすべてを収集します。各サンプルについて、光学キャップと新鮮なPCRチューブに一定分量の油の30μLを、オイルの上に液滴を20μlを移します。一貫性のあるボリュームは、アッセイは、交流としてであることを確認しますできるだけキュレーション。
5. 閉じるチューブのキャップをしっかりと、ルーズキャップは、油が蒸発することができます。

4.等温増幅

1. PCRサーモサイクラー、定量PCRサーモサイクラー、またはホットプレートを用いて、7時間、30℃でサンプルをインキュベートし、そして75℃で1分間の不活性化。液滴のチューブは、この時点で数時間ホイルで覆い、冷蔵庫に放置することができます。

5.データ収集と分析

1. 直ちに反応不活性化の後、定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべての試料について、色素の蛍光レベルを測定します。最適フィルタの設定は、色素の励起および発光スペクトルに依存するであろう。この例では、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。他の蛍光測定技術は、蛍光を定量化するために使用することができます。
2. 各サンプルについて、によって二本鎖DNA結合色素の蛍光強度を分割参照色素の蛍光強度。すべてのサンプルから、バックグラウンド蛍光、または全くテンプレートコントロールの正規化された蛍光を引きます。
3. 標準から補正された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。 NTC標準は0％、蛍光滴（「すべて陰性」）、および高鋳型濃度の蛍光測定したサンプルについての蛍光を表す（「すべての正」）の100％蛍光液滴を有する試料の予想蛍光です。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。

6.生産液滴実証の原理測定のための

1. 蛍光（正）の液滴を作る：0.1 ngのラムダDNA、1×二本鎖DNA結合色素、1X参照色素​​、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5メートルからなるPCR反応液を調製MのMgCl _2、0.2mMのdNTPを、および0.5μMのプライマー。上記のように混合物を30時間（20秒、20秒、1分間72°C、55°C、95°C）熱サイクルは、液滴を形成します。
2. メイク非蛍光（陰性）小滴：1XのdsDNA結合色素、1X参照色素、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl _2、0.2mMのdNTPを、からなるPCR反応混合物を調製しますおよび0.5μMのプライマー。混合物を30時間（20秒95℃、20秒、1分間72°C、55°C）は、その後の液滴を形成する熱サイクル。
3. プレミックスの液滴の比率を形成
   1. 定量PCRチューブにフッ素系オイルを20μlを配布し、蒸発を防ぐため、光学キャップでカバーしています。
   2. 油の上に負の比：優しく希望正でよく混合液滴の10μLをピペット。示された結果では、正：負の液滴比は1（すべて正）、0.8、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001、0（すべて陰性でしたative）。
4. 定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべてのサンプルについて、色素の蛍光レベルを測定します。このプロトコルでは、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。
   1. 二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、「すべての陽性」のサンプルの蛍光によって正規化します。
5. 「すべての正」と「すべての否定」のサンプルから正規化された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。
6. 各比率（n = 3）を独立した液滴の形成と各反復のために混合しながらのための実験を​​繰り返します。

7.実証の原理MDA実験

1. スペックでラムダDNAストック溶液の濃度を測定しますtrophotometer。
   1. 1滴あたり平均10テンプレート分子に必要なテンプレートの濃度を計算します。このプロトコルでは、液滴体積は1 NLとラムダDNAを1 ngのは、約1.9×10 ^7コピーが含まれていると仮定します。そのため、1滴あたり10テンプレートはNLあたり10コピー、または1μl当たり526 FGラムダDNAとなります。テンプレートには、液滴が形成されている場合〜6倍、したがって、初期最高テンプレート濃度が3.2 PG /μLになる希釈化することになります。
2. 逐次変性バッファーと同体積の中和バッファー3.2 PG /μlにラムダDNAを希釈します。 0.1の希釈率は、変性バッファーの45μlの10μlのサンプルを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。クエンチするために中和バッファーの45 LLを追加します。
3. 実験用サンプルの残りの部分を作るためにステップ7.2で説明したように、試料を希釈します。示す反応における初期鋳型濃度は、3.2 PG、320 FGました160 FG、32 FG、16 FG、3.2 FG、およびマイクロリットル当たり1.6 FG。
   注意：マスターミックスの添加後の最終的なテンプレート濃度は526 FGた、52.6 FG、26.3 FG、5.26 FG、マイクロリットル当たり2.63 FG、526社、263社。 10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、およびそれぞれ1滴あたり0.005期待ラムダコピー。
4. 生成し、ステップ2.5から5.3に記載されているように、各サンプルからの液滴を分析します。
5. デジタルカメラを使用して示す蛍光画像（ 図2,3）は、室温で10倍の対物レンズと落射蛍光顕微鏡に取り付けられ得ます。各サンプルのビューの12のフィールドを取得します。蛍光スライドを用いて得られた背景画像で補正蛍光画像。
6. エマルジ ​​ョンオイルはすぐに蒸発するように、撮像³⁷に含まれるチャンバーを使用してください。
7. ImageJのマクロ（補足コードファイル）を使用して、個々の液滴の強度を分析します。
   1. 最高のNに非蛍光滴を分離する閾値蛍光強度を選択します高濃度のテンプレート画像内の蛍光液滴からTCの画像。各未知試料について、閾値より上の蛍光強度との液滴の割合を計算します。

8. PCRおよびMDAバルク反応

1. PCR反応を準備します。
   1. 直列0.1の希釈率で鋳型DNAを希釈します。各希釈のために、変性緩衝液45μlのテンプレートを10μlを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの45μlの希釈を組み合わせます。
   2. サンプルあたりのPCRマスターミックス20μlのを準備します。 1.1倍PCR反応マスター混合物は、60単位/μlのTaq DNAポリメラーゼ、11mMのトリス-HCl、55ミリメートルのKCl、1.65ミリモルのMgCl _2、0.22 mMのdNTPを、1.1倍のdsDNA結合色素、1.1倍の参照色素、および550nmの成り各プライマー。
   3. 希釈されたテンプレートを2μlとマスターミックス20μlのを兼ね備えています。
      注意：最後の鋳型濃度トンで彼が示したPCR反応50頁、5頁、500 FG、マイクロリットル当たり50 FG、5 FG、500社、および0グラムラムダDNAたし、三連で行いました。
   4. 以下のプログラムでのqPCR機における熱サイクルのPCR反応。 2分間72℃で2分間前に30秒、30秒、20秒57℃、72℃、95℃の40サイクルを実行し、4℃で保持します。
   5. 二本鎖DNAは、更なる分析の前に参照色素蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。
2. MDA反応を準備します。
   1. ステップ8.1.1で説明したようにサンプルを希釈します。
   2. 氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2倍MDA反応マスター混合物は、2倍のdsDNA結合色素、2倍のリファレンス色素、オリゴランダム化、50μM、2 mg / mlのBSA、2倍のファージphi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼフリー水、および40 / mlのから成りファージPhi29 DNAポリメラーゼ。
   3. ポリメラーゼdを確保するために、最後の40μg/ mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼを追加OESは、7.5よりもはるかに高いまたは低いpHレベルは発生しませ。よく混ぜます。
   4. 定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの希釈したテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLを加えます。
   5. 変性テンプレートの10μLとマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。
   6. 以下のプログラムで定量PCR機にMDA反応を実行します。
   7. 4時間30℃で保持し、蛍光ごとに7.5分を測定します。
   8. 1分間75℃で不活性化します。
   9. 二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、各サンプルの最大蛍光により正規化します。

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結果

従来のバルク/リアルタイム読み出し定量PCRおよび定量WGAアッセイ（ 図1）の両方に使用することができるが、デジタル定量的アッセイは、利点がある （表1）を提供します 。記載された方法では、単純なバルクエンドポイント測定（ 図2）を用いて、マイクロ液滴形式のデジタル分析を読み出します。この方法は広く適用可能であるが、この...

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ディスカッション

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evagreen Dye	Biotium	31000
Bovine serum albumin	New England Biotechnologies	B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer	New England Biotechnologies	B0269S	Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA	New England Biotechnologies	N3011S	Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos	Integrated DNA Technologies		5'-NNNNN*N-3'
PCR primers	Integrated DNA Technologies		5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water	Life Technologies	10977-015	UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye	Life Technologies	12223-012
PCR optical strip caps	Life Technologies	4323032
PCR tubes	Agilent Technologies	401428
dNTP (25 micromolar each)	Agilent Technologies	200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system	Agilent Technologies	401403
Barrier pipette tips	VWR	89003-046
Bio-rad oil for evagreen	Bio-rad	186-4005
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893-100RXN