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要約

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

要約

新しく単離した腫瘍特異的内皮細胞（TEC）は、腫瘍の血管新生の分子機構を探索し、癌の新規血管新生阻害剤を開発するためのインビトロモデルとしての役割を果たすために使用することができます。しかし、マウスの内皮細胞（EC） の in vitroでの展開での長期起因非ECに表現型の文化のドリフト（内皮-間葉移行）や汚染に困難です。これは容易に培養液中の共精製された線維芽細胞または腫瘍細胞によってoutcompetedされているTECに特に当てはまります。ここでは、コロニーの選択にインビトロで結合された拡張免疫磁気濃縮を利用する高忠実度の分離方法について説明します。このアプローチは、間質細胞または腫瘍細胞の汚染の全く自由である純粋なECの画分を生成します。また、その系譜トレースCdh5のCREを示している：本明細書で説明するプロトコルで使用ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウスは、セルを検証する貴重なツールですこれらのマウスから単離したECコロニーとして純度は、文化の中で、耐久性と鮮やかなZsGreenの蛍光を示します。

概要

内皮細胞（EC）は、固形腫瘍の開発中に必要不可欠です。休眠腫瘍における血管新生スイッチの開始から離れた部位に転移の普及と播種に、ECは、血液を提供導管を形成する酸素および栄養素は、腫瘍増殖1を維持します 。最近示唆したように、ECはまた、灌流独立した機能を有しており、がん幹細胞および他の腫瘍間質細胞2-5の増殖を支持するニッチを形成します。このように、高度に精製された腫瘍特異的EC（TEC） のin vitro培養のための腫瘍血管新生および腫瘍細胞とのクロストークを仲介する新たな分子メカニズムの解明に役立つであろうルーチン機能研究を可能にします。

ECの起源6の組織に応じて高度に専門化しています。異なる腫瘍タイプの不均一な性質及び腫瘍微小環境に、TECはまた、腫瘍特異的分業Oを反映して独自の機能が表示されることがあります血管系F。例えば、異なる種類または腫瘍7,8のグレードから分離されたTECにおける遺伝子発現シグネチャの著しい変動があります。しかし、TECと、特に腫瘍関連線維芽細胞および腫瘍細胞、非ECの同時精製頻繁には、ゲノムワイドな発現解析を混乱することができます。これらの望ましくない細胞型は、TEC培養物のインビトロでの拡大を長期的に依存している研究では特に問題です。

ここで説明するには、一貫して腫瘍および他の組織からの純粋なEC培養を生成し、高忠実度の方法です。 EC画分と共精製された非ECの除去の免疫列濃縮した後、追加のクローニングリングステップは9を使用している純粋なECコロニーをキャプチャします。各コロニーは、非ECを汚染することなく、複数出現継代培養で増殖することができます。また、この方法は、遠藤の研究のための理想的である単一の単離手順、から複数のECクローンをもたらしthelial異質。 ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウス文化10でZsGreen蛍光を維持する「運命マッピングされた」と消えないマークされたECを生成するための貴重なツールです。また、Cdh5 CREがいることを示しています。プロトコルへの微調整では、この方法は、異なる腫瘍タイプまたは正常組織に適応する必要があります。

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プロトコル

以下のプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で実験動物医学科によって確立されたガイドラインに従って実施されます。

1.開始する前に、以下の材料および試薬を準備します

  1. 50ミリリットルの熱不活性化ウシ胎児血清、50ミリリットルのNu-血清IV、抗生物質 - 抗真菌5ミリリットルと400ミリリットルを低グルコースを補充することにより、ECのメディアを準備します（1グラム/ LのD-グルコースまたはLG）ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）そして、のhFGF、VEGF、のhEGF、R3-IGF-1、および市販のキットからのヘパリン成分は。
  2. 500 mLのFACS緩衝液（0.5％BSA、PBS中の2mM EDTA）を調製。滅菌0.22μmのフィルターカップを通して濾過します。
  3. 滅菌またはボードを解剖消毒。
  4. 解剖ピン、手術用はさみ、および解剖器具を滅菌します。

2. EC単離（1日目〜5時間）

  1. 二酸化炭素または他の方法に準拠し機知にマウスを安楽死させます時間制度動物実験委員会（IACUC）方針。
    注：サイズが異なる複数の乳腺腫瘍（5 - 直径15mm）は、このようなC3-TAGのような単一の遺伝的に改変マウスで開発することがあり、TECの分離のためにそれらのすべてを収穫してください。単一のEC単離のために同所性マウスに移植している腫瘍、プール2 1 3センチ3の腫瘍を使用した場合。ここでは、デモンストレーションとしての乳腺腫瘍を使用したが、プロトコールは、腫瘍の他のタイプに変更することができます。
  2. 噴霧または、75％（v / v）のエタノールの十分な量で、マウス腹側を拭いて、マウスを消毒します。
  3. 無菌フード内やクリーンベンチで無菌技術を用いて、ハサミや解剖の1組で腫瘍を切除します。
    1. 伸ばし解剖ボード上のマウスの四肢を固定します。腹膜を開かずにハサミで正中切開腹を行います。皮膚腫瘍が配置されている乳腺に向かって腹膜の間に横方向に解剖。腹膜を開けないでください。
    2. 消費税​​のみ腫瘍乳腺組織から、正常な乳房余白を残します。慎重に、皮膚や筋肉などの非腫瘍組織を切り落とすと、氷上でLG-DMEM 30 mlを含むコニカルチューブに解剖した腫瘍を配置します。
  4. 組織培養フードに腫瘍サンプルを持参。 2回 - 無菌LG-DMEM 1で組織を洗います。
  5. 無菌の組織培養シャーレへのコニカルチューブから転送腫瘍は、皿にLG-2mlのDMEMを追加し、片に滅菌ハサミ<5 mmのミンチ。
  6. PBS中、ディスパーゼの1ミリリットルを（ストック=ハンクス液中の2mg / mlの、HBSSを以後）コラゲナーゼの5ミリリットルを追加します（ストック= HBSS中2.5 U / ml）およびデオキシ75μlの（株= 1 mg / mlの）ペトリ皿に。トータルボリュームは今〜10ミリリットルです。
  7. （予め設定された解離PR組織解離管にペトリ皿からコラゲナーゼ/組織ミックスを移し、二回60秒のための組織解離で実行解離にogram：1回あたり1,270合計ラウンド）。光は37℃で75分間シェーカー上で振盪しながらインキュベートします。
  8. フィルターを50mlコニカルチューブの上に100μmのセルストレーナーを通して組織を消化しました。残りの細胞を洗浄するためにFACS緩衝液5mlでフィルターを洗浄します。 5分間280×gでスピンし、慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
  9. 滅菌水9mlの株式RBC溶解バッファー（10倍）の1ミリリットルを希釈します。溶解緩衝液（1×）の10 mlの溶解赤血球、すぐ280 X gで5分間回転さ。注：少し血が表示されている場合、この手順はスキップすることができます。
  10. FACS緩衝液10ml中に再懸濁。トリパンブルーの10μlの細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を使用して生細胞を数えます。
  11. 〜10 7細胞 /100μlので細胞を再懸濁します。 100μlの細胞懸濁液あたりのFcRブロックの10μlを添加し、氷上で10分間インキュベートします。
  12. ラット抗マウスPE結合CD31抗体を追加。たまに15分とフリックチューブ- 表1に10氷上でインキュベートします。
  13. 5分間280×gでチューブとスピンにFACS緩衝液10mlのを追加します。注意深く上清を除去し、FACS緩衝液5mlで再び細胞ペレットを洗浄します。細胞をペレット化するために遠心分離。細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引。
  14. 表2に記載の FACS緩衝液および抗PEマイクロビーズを追加10氷上でインキュベートする- 。15分。時折フリックチューブ。
  15. 5分間280×gでFACS緩衝液とスピンのサンプルの10ミリリットルを追加します。再びFACS緩衝液および遠心5mlで1回洗浄。ペレットを乱すことなく上清を吸引。
  16. FACS緩衝液中で300μlにボリュームを持参してください。 280 X gで5分間、35ミクロンの細胞ストレーナーキャップ付きチューブを介してスピン。必要に応じて2チューブと、より大きなボリュームを使用してください。
  17. 、フード内で磁気multistandと磁気カラムを設定し、セパレータに列を添付し、FACS緩衝液2mlでカラムを平衡化。
  18. AspiratE上清と0.5で細胞ペレットを再懸濁 - FACS緩衝液1ml。
  19. 平衡化した磁気カラムを通して細胞懸濁液を渡します。
  20. FACS緩衝液2mlでカラムを3回洗浄し、15mlチューブ（FT画分）にフロースルー（FT）を収集。
  21. セパレーターオフ列を取り、別の15mlチューブ（溶出画分）にFACS緩衝液2mlで溶出します。すべてのセルが列をオフであることを確認するために、プランジャーを使用してください。毎回バッファーFACS 2mlの溶出をさらに2回繰り返します。
  22. 5分間280×gで溶出液をスピン。
  23. 上清を除去し、EC培地10mlにペレットを再懸濁。
  24. 同様に10cmのゼラチンコートディッシュに溶出画分（〜6ml）に分割します。 3 1 cm 3の腫瘍については、プレートは、少なくとも4つのプレートで細胞を溶出しました。複数のプレートで、異なる濃度の代わりに、プレートを溶出した細胞（ 例えば 、0.5ミリリットル、1ミリリットル、1.5ミリリットル、及び4枚のプレートに溶出液の3ミリリットルをシード）ことを確実にするためにトン少なくとも一つのプレートがまばらに溶出細胞を播種されます。 （ - 2.0×10 5細胞が付着すなわち、約1.0）付着した細胞の密集度が〜1％で、次の日であることを確認してください。
    注：細胞は、ECのコロニーは、他の細胞種によって汚染されることなく形成することができるように、スパースメッキされる必要があります。
  25. 1 10cmディッシュでプレートのFT画分は、細胞は、O / Nを回復させます。翌日、100％コンフルエント - プレートが80であることを確認してください。細胞（-80℃）250μlの細胞凍結培地中にクライオチューブ内を下に凍結し、翌日、液体窒素に保管してください。注：FTフラクションは、後の段階で腫瘍細胞の単離および/または単離されたECクローンのEC遺伝子発現解析のための陰性対照として使用することができます。
  26. 3日 - ごとに2メディアを変更します。 10日 - コロニーは7の後に形成し始めます。小型のECコロニーが皿の底に先の細いマーカーで早くも3日目としてマークするコロニーを同定することができます。
  27. 非特異的なCを削り取ります無菌の200μlのpippetチップで識別されたコロニーを取り巻くells。

クローニングリングを使用3.コロニーセレクション

  1. 3日 - ごとに2メディアを変更します。 7日 - ECの純度は約5でLDL（DII-AC-LDL）を添加することによって確認することができます。 10ミリリットルのEC媒体ごとのLDLの50μLを加え、3インキュベート - 蛍光顕微鏡下で細胞をチェックする前に4時間。
    注：複数のLDL + ECクローンは、〜7日目に観察することができました。
  2. 大きさが5ミリメートル - 彼らは3の直径に達したときのECコロニーを収穫開始。 （最良の結果を得るための小型LDL +細胞が充てんされて大きなコロニーを選択してください。）
  3. クローニングリング、0.5％ゼラチンでプレコート数6ウェルプレートでECを回収する前に。吸引しゼラチン、各ウェルにECメディアの2ミリリットルを追加し、必要になるまでインキュベーターにプレートを保ちます。
  4. 他の細胞型はクローニングリング内に捕捉されませんを確認するために、コロニーの縁に非ECを削り取ります。
  5. 使い方位相差顕微鏡（4Xまたは10X目的）は、培養皿の底に先の細いマーカーで概説ECコロニーを含む領域。
  6. 10mlのPBSでプレートを洗浄し、吸引したときに、プレートにPBSの非常に薄い層を残します。 （重要：少量のPBS（〜0.5ml）をクローニングリング手順中に生きている細胞を維持します。また、組織接着剤は、結合に水を必要とします。）
  7. 適切なサイズのクローニングリングを選択してください。リングを拾うために解剖ピンセットを使用し、10μlのピペットチップを均等にクローニングリングに組織接着剤の少量を適用します。
    注：リングのクローニングに組織接着剤の最小限の量（小さなリングのための〜0.2μl）を使用し、組織接着剤は、良好なシールを確実にするために、底面の周りに均一に広がることを確認してください。過剰な組織接着剤は、熱を生成し、細胞を死滅させることができるフィルムを形成します。
  8. ECコロニーの上クローニングリングを置きます。優しく里を接着するためにクローニングリングを押し下げますプレート上にngの。コロニーがリングを接着前に乾燥されていないことを確認してください。
  9. すぐにクローニングリングに酵素的細胞剥離溶液25μlをピペットと〜1分間インキュベートするか、細胞が緩く付着されるまで。
  10. クローニングリング滴下予熱EC培地を含む6ウェルプレートの1ウェル中にピペットで細胞。 50でクローニングリングを洗う - できるだけ多くの細胞を収集するために、100μlのECメディア、および同じ6ウェルにすべての洗浄を転送;：（。重要ECはタイトなクラスターに成長することを好む細胞を分散させるためにプレートを振らないでください） 。
  11. 10cmディッシュ内のいくつかのコロニーが収穫するには小さすぎる場合、コロニーはさらに数日間増殖させ、10ミリリットル新鮮な培地を追加し、再びクローニングリングの手順を繰り返します。
  12. 10cmの組織培養皿でそれらを拡大する前に、6ウェルプレートの3ウェルに細胞を100％コンフルエントと転送 - 80まで6ウェルプレート中に採取したコロニーを成長させます。汚染物質の細胞を削り取ります。繰り返し必要に応じて - リングの手順（3.10ステップ3.5）をクローニングの別のラウンド。拡張時 - （70％〜60）は比較的コンフルエント細胞を保管してください。あまりにもまばらなメッキ場合ECが成長している停止することがあります。
  13. など、FACS、染色、PCR法により、ECを特徴づけるはディル-AC-LDLは蛍光性であるし、FACSのためにPEまたは他の蛍光抗体を妨げる可能性があることに注意してください。

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結果

ECは、ほとんどの成人組織11の総細胞集団のわずかな割合を表しています。これは、完全に細胞外マトリックス（ECM）および結合組織からECの最大放出を確実にする単一細胞懸濁液中に採取した組織を消化することが重要です。我々の経験では、CD31媒介免疫磁気選択は、濃縮されただけではなく、純粋なEC画分を提供します。従って、別の重要なステップは、クローニングリング（

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ディスカッション

これにより、純粋な一次TEC培養、例えば、ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）13として市販されているEC線や主要EC を用いたin vitro の研究で多くの代替TECを得ることが困難に。しかし、正常組織からこれらのEC集団は、それらの正常な対応物とは著しく異なるTECのためのプロキシとして機能することができます。例えば、TEC は 、生体内で表現型および機能的異常である?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-Antimycotic Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads Miltenyi Biotech130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%Gibco15260-37
Cell freezing media (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Collagenase type II  Worthington BiochemicalLS004176Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture gradeSigma-AldrichG1393-100MLDilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotech130-092-575
Neutral protease (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibodyBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 % Life Technologies15250-061
10 mm tissue culture dishesCorning
15 ml conical tubes (sterile)Corning
50 ml conical tubes (sterile) Corning
6-well tissue culture platesCorning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Cell strainer 100 μm Corning352360
Cloning rings (assorted sizes)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
Dissecting boardSterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use 
Dissecting forceps and scissorsSterilize before use 
Dissecting pins 2"Sterilize before use 
FACS tubes with 35 μm filter capCorning352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)MilliporeSCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
Magnetic MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)3M1469SB
CentrifugeEppendorf5810ROr a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation 
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope

参考文献

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