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要約

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

要約

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

概要

多くの動物は種内の通信のための発声を使用しています。マウスハツカネズミでは、通信信号の一つの重要な種類は、20kHzのより高い周波数を有する超音波発声（USVs）、です。マウスによって放出されたUSVsは男女1-4、メス-メス1、5、およびオス-オス1、6相互作用における社会的認知のコンポーネントと考えられています。彼らは自分の彼女の子犬-検索行動を増加させ、母、ため、仔の生存7から隔離されたときにUSVsも子犬によって放出されます。多くの報告がマウスUSVs 8,9を分析し、分類しているが、受信動物の行動反応と神経機構は少ない10、11を文書化されている。後者はUSVsの諸特性の生物学的意義を明確にする必要があります。これらのメカニズムを明らかにするために、再生実験は、効率的な方法です。最近の再生の研究は、女性のことを明らかにしましたマウスはUSVs 12に引き寄せられ、彼らは彼らの親13、14から異なっている男性からUSVsを好むこと。

この記事では、マウスのUSVの好みを評価するために使用される再生テストを説明します。二選択試験箱を図1に示すように、2つの異なるUSVsは、試験容器の二つの区画に同時に再生することが可能で開発された。試験箱のこのタイプは、三つのサブチャンバ内にテスト領域を分割して音声汚染を防止、鉛の壁を使用。超音波エミッタが各部屋の外に位置しています。部屋や超音波エミッタとの間の壁にはワイヤメッシュで覆われた穴があります。マウスは、3つの部屋の中で自由に移動し、超音波エミッタによって再生USVsに応答するかのように、「メッシュを検索する」の挙動を示すことができます。この試験では、マウスは1音エミッタまたは他の近くに異なる期間の期間にご利用いただけます。これらのパラメータは、敏感measuを得るために記録することができます音の好みの再。

バックUSVsを再生するには、ナノ結晶シリコン熱音響放射体（ すなわち 、「NC-Siのエミッタ」）は、以前の研究15-17のように使用されました。これらのデバイスは、薄膜ヒータ電極、ナノ多孔質シリコン層、及び単結晶シリコンウエハで構成されています。デジタルサウンドファイルは、アナログ信号に変換された後、ヒータ電極を通過します。デバイスは、低歪みと有意な音圧に生じる電圧に依存する熱信号に変換します。この装置は、その中で一意である、機械的な振動に依存する共通の音源とは異なり、振動板を必要とせずに音を再生することができます。エミッタは、20から160キロヘルツ（ 図2）の周波数で平坦な音圧レベルを示し、持続時間、周波数、音圧レベル15、18、19の観点で非常に正確にデジタルで記録されたネズミUSVsを再生することができます。

図3に示す代表的な実験においてve_contentは">、C57BL / 6（B6）雌のBALB / c（BALB）との間で雄USVsとバックグラウンドノイズを選択させた。また、 図4は、間にB6とBALB女性の選択肢を示していますBALBとB6の男性からの同時USVのプレイバックは、以前の研究で報告されているように14。男性のUSVsの特徴は、B6の間で異なり、BALBは20菌株 。これらの結果により、USVsの魅力が存在するプロトコルを用いて評価することができます示されているように、ここで音は、生きた個体から記録された音響的に分析し、他の個体に再生されます。

プロトコル

すべての手順は、麻布大学の倫理委員会によって承認されました。全ての実験は、防音室で行いました。

1.動物の準備

  1. 記録のための男性
    1. 交配の経験が性的に成熟した雄マウスを入手します。
  2. 女性被験者
    1. （ - 12週齢通常8）ケージあたり2〜5同腹子に収容されてきた処女雌マウスを入手します。
    2. マクリーン21によれば、試験前の発情周期の位相を決定するために、毎日の膣スメアを取得します。ケアは、偽妊娠を避けるために、膣の刺激を最小限に抑えるよう注意が必要です。
    3. ギムザで塗抹標本を染色し、白血球、角化上皮細胞、および有核上皮細胞の有無に基づいて発情周期の位相を決定し、ネルソン22によります。

2. [デバイス（図1）

_content "> figure-protocol-508
二つの選択肢のテストボックスとデバイスの図1の回路図。マウスは、彼らとニュートラルゾーンの間に位置する小さなゲートを介して部屋AとBにアクセスすることができます。二選択ボックスと2つの超音波エミッタは防音室の床に置かれています。マイクは防音チャンバー内に吊り下げられています。略称：PC、パーソナルコンピュータである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 記録のために
    1. USB型A / Dコンバータを使用してPCに超コンデンサーマイクを接続します。
    2. 「7」にA / D変換器のゲインレベルを設定します。
    3. オーディオキャプチャソフトウェアを使用して、400 kHzでのサンプリングレートで16ビット形式のファイル内の音響データを記録します。
  2. 再生のための
    1. 使用してPCにD / A変換器を接続しますUSBインターフェース。
    2. 減衰器を介してD / Aコンバータへの2つのアンプを接続します。 （後者のデバイスは、過負荷を防止するためのものです。）
    3. 各アンプに超音波エミッタを接続します。

3. USV録音

  1. 側壁で直径6cmの穴0.5センチ金網で覆われた穴小（17×10×11センチ）または中型（21×14×13 cm）のケージにオスのマウスを置きます。中型ケージを使用する場合は、面積を減少させるために、ケージの中央を横切って、パーティションを構成します。
  2. 録音を汚染する可能性がカサカサ音を回避するためにケージ内のベッドを使用しないでください。
  3. メッシュの横にマイクを置きます。
  4. ステップ2.1に示す記録セットアップと超音波発声の監視を開始します。
  5. 雄マウスとケージの中に発情後期または発情間期のいずれかで性的に成熟した雌のマウスを置きます。
  6. 5分 - 3のレコードUSVs。

4. TESTボックス

  1. アクリル板（ 図1）を使用して、テストボックスを作成します。
    注：ニュートラルゾーン（15×20 cm）であり、部屋AとB（20×10センチ、それぞれ）：試験箱（35×20、および×20センチの高さ）は、3つの区画に分割されています。客室AおよびBは、それぞれ0.5センチメートル金網で覆われている4 cmで径孔を有します。穴やメッシュは中立ゾーンと部屋AとBの間の部屋A、Bの各端作るゲート（5×5センチメートルそれぞれ）に配置されています
  2. 音漏れを防止するためには、各メッシュの周囲のボックスにそれらをシール、ゴム板を使用して、メッシュに面する側を除いて、各超音波エミッタを絶縁します。
  3. 遮音のために部屋AとBの間の壁の両側にリードシールを置きます。

5.サウンド再生の準備

  1. 再生音の作成
    1. デジタルオーディオ編集ソフトウェアを使用して記録されたファイルからUSVの20秒のセグメントをキャプチャします。
    2. 背景なしを選択し、キャプチャ20秒USVセグメントファイルからISE（0.35秒）。雑音区間を繰り返すことにより、20秒のバックグラウンドノイズファイルを作成します。
    3. 同時に2つのサウ​​ンドファイルを再生するには、「左耳」とのために、他のファイルに1つのファイルで、単一のステレオサウンドファイルとして書き出す」右耳。」
    4. 40kHzのカットオフを用いて、高域通過フィルタを使用して音声ファイルをフィルタ。
    5. 後処理ソフトウェアでノイズリダクションツールを使用してノイズを低減します。選択し、ノイズ低減プロファイルとして何のUSVsを含まないファイルのセグメントをキャプチャし、レベル40とノイズリダクションを実行します。
  2. 再生音のキャリブレーション
    1. 超音波エミッタとマイクの間のスペースは10cmであることを確認してください。
    2. 超音波エミッタからの音圧レベルを較正するために、ステップ2.1で説明した構成を用いた超音波モニタリングを行います。デシベル（dB）でマイクで音圧レベルを測定します。
    3. USIアッテネータとアンプをngの、ステップ3で記録された男性のUSVsと同じ音圧レベルに超音波エミッタによって生成されたUSVsの音量を調整します。
    4. 2つの超音波エミッタとUSVs及び背景雑音からなる音声ファイルを使用する場合、2つの超音波エミッタは、行動試験を行う前にキャリブレーション音（例えば、75 kHzの純音）を使用して、同じ音圧レベルを示すことを確認します。
    5. USVsの二つの流れから成るサウンドファイルを再生する場合、テストの前に、同じレベルに生成された2つの音圧レベルを調整します。

6.二選択テスト

  1. 試験箱のメッシュの後ろに超音波エミッタを配置します。
  2. アクリル板付きの客室、A、Bにゲートを閉じ、30分間のニュートラルゾーンに女性対象を慣らします。マウスが逃げることができることを避けるために、アクリル板で箱をカバー。
  3. CCを使用して録画を開始しますDカメラは、ボックスの上に取り付けられました。カメラ（ 図1には図示せず）は、全ての3つの区画の面積をカバーします。
  4. ゲート及びカバーボードを取り外し、女性が自由に音のゾーンを含む試験箱を探索することができます。
  5. 女性が両方のメッシュを調査しており、ニュートラルゾーンに戻った後は、5または10分間繰り返し、20秒のサウンドファイルの再生を開始。
  6. 5または10分間の行動監視を行っています。
  7. 前の対象から堆積望ましくない嗅覚を減らすために、70％エタノールを用いた試験の間に試験ケージを清掃してください。
  8. ランダム部屋AまたはBに向けて固有の側バイアス効果を避けるために、超音波エミッタAとBの場所を切り替えます

7.統計分析

  1. 行動イベントスコアのソフトウェアを使用して、次のパラメータを分析：各部屋内のエントリの総数を、各中間ゾーンでの滞在時間の合計。各サウンドゾーンの滞在時間の合計。と超音波エミッタの前に各メッシュの検索の合計時間。 図1は 、「ミドルゾーン」とが何を意味するのかを示して、「サウンドゾーン"。
    注意：マウスは、2つのゾーン間の境界線上にとどまる場合には（ 図1、破線は）ヘッドの方向によって位置を決めます。ヘッドメッシュ側を向いている場合には、音声区間での滞在として記録されます。
  2. 各行動パラメータについては、ウィルコクソンの符号順位検定を使用して部屋AとBの応答を比較し、または0.05の有意水準でのt -testsをペアリング。

結果

USVs は 、図3に示す代表的な実験に聞こえる再生として使用された1 BALB男性（20秒あたり161音節）と同様に、バックグラウンドノイズから記録した。この実験では、7メスのB6マウスは、生後9週で使用しました。サウンドを再生する女性の応答のテストの最高の持続時間を決定するために、行動パラメータは合計10分間の試験時間の最初と最後の5分間別々に分析しまし?...

ディスカッション

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib...

開示事項

The authors declare that they have no competing interests.

謝辞

この作品は、費補助金JSPSフェローのためのAAにすることによってサポートされていました。 ;費補助金のために日本学術振興会科学研究員のための革新的な分野にTKへ（第4501号及び25132712）によりますそして、麻布大学。 図2によって授与研究プロジェクトの助成金によって木原、T.、原田、T.、＆越田、N.ウェハー互換製造およびナノ結晶シリコン熱誘起超音波エミッタの特性から転載されました。 センサおよびアクチュエータA：では、物理 、ボリューム125、エルゼビア、P。 426、（2006）、エルゼビアからの許可を得て。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Soundproof chamberMuromachi Kikai
Small cageCLEA JapanCL-0113-1
Middle cageCLEA JapanCL-0103-1
Ultrasound condenser microphonesAvisoft BioacousticsCM16/CMPA
A/D converterAvisoft BioacousticsUltraSoundGate116H
Audio softwareAvisoft BioacousticsRECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing softwareAdobe SystemsAdobe Audition 3.0
Nc-Si emitterOriginalnot commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converterNational InstrumentsNI USB-6251 BNC
AttenuatorOriginal
AmplifierYamatake
PCWindows 7 professionalIntel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring softwareoriginalProgrammed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)Tokyo bouonTI-75BK B4Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solutionMerck Millipore1.09204.0500

参考文献

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