FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

要約

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

要約

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.

By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

概要

細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク^1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が^（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て^11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ¹⁶の微小レベルの定量を可能にします。

安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取り込みまたはタウ種のリポソーム媒介形質導入、しかし、フローサイトメトリーを介して、単一の細胞内で測定されるFRETシグナルを生成RD-CFPとRD-YFPの集約、で結果。

このアッセイの多数の構成要素は、感度を高め、ばらつきを低減するように設計されました。 1を有するモノクローナル細胞株：それは最適な信号を提供するよう1 RD-CFP / YFP発現率は、選択された：ノイズを。感度を高めるために、リン脂質は、直接細胞内に種子を導入するために使用された（取り込みの生物学的機構を研究するが、これを省略することができます）。最後に、フローサイトメトリーモニタは集団レベル、単一細胞にFRETレベル、他のタンパク質凝集アッセイとは異なり。最終アウトカム指標、統合されたFRET密度は、高度に定量的であり、両方の集合を有する細胞の数、及び凝集は、各セル内で発生した程度を占めます。これらの最適化されたパラメータのすべては、感度を向上させ、再現性を確保します。

このシステムは、最近、他の一般的に使用されるタウ病理学的マーカー （例えば、MC1、AT8、PG5、およびチオフラビンS）にタウ播種活動の相対的な時間的な発症と進行を評価するトランスジェニックマウスP301Sタウオパチー¹⁷に包括的な研究で用いました。シーディング活性は、少なくとも6週間の組織学的検出の前に、これまでで評価しタウ病理の初期の、最も堅牢なマーカーです。種まき活動が発症および/ ​​または神経変性¹⁶の進行におけるproteopathic種子の因果的役割を示唆し、年齢とともに徐々に1.5ヶ月と増加に表示されます。

e_content ">生物学的サンプルからのシード材料の微細なレベルの正確な定量化は、初期の疾患の進行をモニターする研究を容易にすることができる試験の期間を短縮し、より若い動物の使用を可能にすることで、これは前臨床動物試験の効率及び精度を高めることができる。例えば、でP301Sマウス先に述べた、鉛化合物は、初期の4〜6週間ほどお届けすることができ、2〜4週間後に有効性について監視。アッセイが正確に播種内の任意の削減を定量化する必要があります（または播種活動の開始時の直前に）アクティビティ。フローサイトメトリーFRETは、同様にインビトロスクリーニングの用途を有する。例えば、抗タウ試薬（ 例えば、抗体 、小分子など ）、組換えタウを使用して、培養物中に直接播種誘導をブロックする能力について迅速に試験することができますシード源（ 図5）。このセットアップでは、シード材料を準備したら、元のような凝集体または脳由来の溶解物perimentは、データ分析など、完了するまでにわずか3日かかります。 proteopathic播種活動の急速な定量化は、このように神経変性の多くの研究を容易にすることができます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

注：このプロトコルは、マウスの生体サンプルから播種活性を検出するためのFRETフローサイトメトリーの使用を強調しています。それはまた、組換え原線維と人間の生物学的サンプルと互換性があります。マウスを安楽死させ、脳を収穫はIACUC承認手順に従って実施しました。

1.脳抽出

1. イソフルラン（2％）との深い麻酔の後、0.03％のヘパリンを含む氷冷PBSでマウスを灌流し、ゲージら詳細後の脳を抽出します^。18
2. クライオバイアル中で抽出された組織を置き、液体窒素中に配置することによって、凍結スナップ。また、ドライアイス上の組織を凍結します。一度、必要であれば、長期間にわたって-80℃とストアに組織を転送し、凍結しました。
   注：このプロトコルは、全脳ホモジネートまたはマイクロ解剖脳領域と互換性があります。萩原らを参照してください。詳細な顕微解剖プロトコル¹⁹のために。

生物種材料の作製

1. 1×TBS（10ミリリットルあたり1錠）にプロテアーゼ阻害剤（EDTA無料）を溶解することにより、均質化緩衝液を準備します。勢いよくボルテックスし、氷上で保存します。プロテアーゼ阻害剤は、バイオセンサーの細胞生存率を維持するためにEDTAを含まないものでなければなりません。
2. 使い捨て計量ボートに凍結した脳組織を秤量し、5ミリリットルコニカルチューブに移します。最終溶液は、10％重量/体積であるように氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加えます。一時的に氷の上に保管してください。組織塊とそれに続く均質化緩衝液量を用いる脳の大きさおよび/または地域に依存して変化します。ここでは、0.2グラムの体重の成体マウスhemibrainは10％重量/体積溶液2 ml中に懸濁させます。
3. 低温室にサンプルを移し、適切な設定にプローブ音波処理を調整します。 （ここに示されている）オムニRuptor有するプローブ超音波処理のために、サンプルがOVされないように、約75 W.使用パルスモードに対応して20％に電力を設定超音波処理中のER-加熱しました。約500ミリ秒に対応し、30％にパルサーを設定します。
4. 各溶液との間にプローブを拭き取り、再び水、イソプロパノール、水ですすぐことにより、プローブ超音波処理装置の先端を清掃してください。ラボ・ワイプで側面およびプローブの下部の両方をすすぎ、ワイプするようにして。
5. 一度に一つのサンプルと協力して、均質化緩衝液にプローブ先端を沈めて、超音波処理装置を起動します。上記の電源とパルサーの設定を使用して、合計25パルスを提供します。組織が完全に懸濁液中であることを確認してください。このステップの間に、サンプルの発泡を避けるように注意してください。
   注：a）は全体積が低いまたはb）ホモジネートはウォームアップ場合、試料は、発泡性の影響を受けやすいです。この特定の機器を用いて、250μl以下で超音波処理しません。サンプルが冷却した滞在を保証するために、チューブは、このステップの間、氷上に保存してもよいです。
6. その後、ビーカーOに10パルスを送出、残留溶解液を拭き取ることにより、プローブを清掃してくださいFきれいな水。各ステップの間で乾拭き、（ステップ2.4​​のように）再び水、イソプロパノール、水で側面およびプローブの底を洗い流します。汚染を避けるために、徹底的にサンプル間でプローブをすすいでください。
   注：タウ凝集体では、我々はより厳格な洗浄方法は、サンプル間の汚染を防ぐために必要であることを発見していません。他のアミロイドは、しかし、広く文献^20,21に記載されている追加のケアが必要な場合があります。
7. すべてのサンプルが処理されるまで、ストアを氷上にホモジネート。
8. 4℃で15分間21,300×gでホモジネートをスピン。
9. ペレットを乱さないように注意しながら、清潔なチューブに上清を移します。ペレットを廃棄します。さらなる使用のために-80℃で上清、およびストア溶解物アリコート。これは播種効率を低下させるように、しかし、ホモジネートの凍結/解凍サイクルを避けてください。

3.再播種バイオセンサー細胞

注意：このアッセイのための4つの細胞株を使用してください：HEK 293T（細胞株＃1）、RD-P301S-CFP（細胞株＃2）、RD-P301S-YFP（細胞株＃3）、およびRD-P301S-CFP / YFP（細胞株＃4）。アッセイの各細胞株の寄与については、表1を参照してください。

1. 無菌環境で、吸引培地。温かいPBSで細胞を洗浄し、吸引。トリプシン処理細胞を3分間（トリプシンEDTA（0.05％）の3 ml）を、温かい培地（DMEM 9mlを、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％のGlutamax）でクエンチし、そして直ちにに細胞を移しますコニカルチューブ。
2. RTで5分間1,000×gで遠心分離細胞。培地を吸引し、暖かい培地で再懸濁細胞ペレット。
3. 血球計数器を用いて、各細胞株についての細胞密度を決定します。細胞密度は、収穫し、再懸濁体積時コンフルエンスに依存して変化します。細胞密度が約100万細胞/ mlで再懸濁する細胞を、10 mlの培地中で90％の集密度で10cmディッシュから回収しました。
4. メイク細胞+各ウェルの96ウェルプレートを130μlの培地中に35,000細胞を含有するようなメディアのマスターミックス（100井戸のためのマスターミックスを作るために例えば 、13ミリリットルのメディアで350万細胞を再懸濁）。個々の実験計画とスケジュールに合わせて、細胞数を変更します。細胞治療のためにプレーティングした後〜18時間、96ウェルプレートの各ウェルに35,000細胞を加えます。
5. 96ウェルプレートを、マルチチャンネルピペットをゆっくり平底の各ウェルにマスターミックスを細胞懸濁液130μLをピペットで、組織培養処理された使っ。メッキが、プレートの底に触れていない、ウェルの中央にピペットチップを置きます。
   注：メッキ形式を変更することができるが、細胞株プレート当たり1-3のそれぞれについて、n = 4の井戸を作ることをお勧めします。プレート（N = 84）の残りの部分は、細胞株＃4（バイオセンサー細胞）用に予約されています。
6. 細胞を室温で10分間邪魔されずにプレートを残すことによって解決することができます。 37℃、5％CO _2、および＆でO / Nインキュベート＃8805;相対湿度80％。

4.細胞を処理します

注：次の日、タウバイオセンサー細胞は、次のようにシード伝達複合体を準備する60〜65％コンフルエントのとおりです。

1. 一本のチューブに、マスター混合物を作るために、そのようなのOpti-MEMとして低減血清培地を用いて、例えば、リポフェクタミンのように、トランスフェクション試薬を組み合わせます。ウェルごとに、1.25μlのトランスフェクション試薬と8.75μlの低減血清培地を追加します。フリックチューブ軽くスピンダウンし、そして室温で5分間インキュベート簡単に、混合します。
2. 別のチューブでは、減少した血清培地でシード材料（ステップ2.9からの溶解物のアリコート）を兼ね備えています。
   注：シード材料の体積は、個々の実験に応じて変化するであろう。シードボリュームを選択する場合、考慮に入れる：サンプル中の種の豊富さと潜在的な毒性を。粗製のホモジネートは、細胞に対して毒性であり得ます。このように、ご希望の効果を監視することができる最低のボリュームを使用しています。溶解液/ウェルの範囲frの以前テストしたボリューム5-20μgの全タンパク質に対応するオム1-5μlを、。ウェルあたりの総容量（種子+低減血清培地）を10μLであることを確認してください。
3. 4.1と4.2で説明した2つの管からのコンテンツを組み合わせて、フリック優しく（千XG、5秒）をスピンダウンし、少なくとも20分間、2時間まで室温でインキュベート簡単に、混合します。
4. 静かに、個々のバイオセンサーウェルの側に伝達複合体の20μLをピペット。可能な場合は、3つの技術の複製を使用してください。 24〜48時間インキュベーターに処理した細胞を返します。ステップ3.6で説明したのと同じ条件でインキュベートします。
   注：リン脂質のアプリケーションは、リポソーム試薬に未露光の細胞をバイオセンサーに蛍光プロファイルがわずかにシフトを導入するので、このセットアップのための適切な負の制御条件は、空のリポソーム（ すなわち 、リポソーム試薬+低減血清培地）で処理されたバイオセンサー細胞です。

FRETフローサイトメトリー用5細胞を収集します

注：細胞 - 一般の収穫前に24〜48時間の後処理 - それは標準の倒立蛍光顕微鏡上のGFPフィルターを使用して、播種活動の予備読み出しを得ることが可能です。シード物質で処理した細胞は激しい点状や網状細胞内封入体（ - B図1A）が表示されます一方、シード材料なしで処理した細胞（ すなわち 、空のリポソーム）は、びまん性蛍光が表示されます。

1. マルチチャンネルピペットを使用して、すべての細胞培地（150μl）を吸引します。トリプシン処理（50μl）を5分間細胞、および150μlの冷やした培養液でクエンチしました。それは、細胞リフティングとその後の細胞の損失を引き起こす可能性があるとして、この段階でトリプシン処理する前に、PBSリンスを含めないでください。ゲーティング戦略を経由して、フローサイトメトリー中に混入し、死細胞および残骸を除外します。
2. すぐに96ウェル丸底プレートに、転送細胞を急冷し、5マイル1,000×gで遠心分離した後RTでのn。
3. 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引し、廃棄します。
4. 静かに、しかし完全に、50μlの2％パラホルムアルデヒド中で細胞ペレットを再懸濁し、10分間インキュベートします。固定はよりクリーンで一貫性のある結果を提供するがまた、実行した細胞は、住んでいます。
5. RTで5分間1,000×gで遠心分離細胞。細胞ペレットを乱さないように注意しながら、パラホルムアルデヒドを吸引し、廃棄します。
6. 静かに、しかし完全に、200μlのバッファサイトメトリーチルド流れを細胞ペレットを再懸濁（HBSS、1％のFBS、1mMのEDTA）および細胞凝集を避けるために、できるだけ早くプレートを実行します。

6. FRETフローサイトメトリー

注：レーザーラインとフィルターセット（ 表2）FRET互換が装備されてMACSQuant VYB、このようなフローサイトメーターを使用してください。このセクション内の各ステップについては、ソフトウェアの96ウェルテンプレートを使用して、関心の井戸をクリックし、[OK]をクリックします「再生」のサンプルの取り込み、フローを開始します。 「新しい分析ウィンドウ」アイコンをクリックしてプロットまたは統計表を作成します。 X軸またはY軸のいずれかのタイトルをクリックし、適切なフィルタを選択することで、個々の二変量プロットの軸のパラメータを変更します。適切なフィルタに関連した電圧を、細胞集団または蛍光シグナルをシフトが増減します。この楽器では、正確な単一セルの監視を確実にするために、<千のイベント/秒を実行します。

1. 細胞集団は、左下の象限になるまで、側方散乱-エリア前方散乱-エリア（FSC-A）の二変量プロット対（SSC-A）、および細胞株＃1の走行では、SSCおよびFSCの電圧を調整してください。ポリゴンツールをクリックして、細胞集団（ゲートP1）を定義します。すべてのゲーティングのためのパラメータは、 図2を参照してください 。
2. FSC-二変量プロット対FSC-H（高さ）を行い、プロット上に「ライブ」をクリックし、P1を選択することで、このプロットにゲートP1を適用します。細胞株＃1では実行している、多角形ツールをクリックし、単一細胞（ゲートP2）を定義します。
3. CFP、YFP、およびFRET：3ヒストグラムプロット、関心のフィルタのそれぞれに1つずつ作成します。プロット上に「ライブ」をクリックし、P2を選択することにより、これらのプロットのすべてにゲートP2を適用します。細胞株＃1動作している状態で、電圧を調整するように、CFP、YFPにおける中央値細胞集団、およびヒストグラムは405 nmのレーザーで細胞を励起し、CFPとFRETを測定し、とキャプチャ蛍光するには、すべての0と1の間にあるFRETそれぞれ450/50 nmおよび50分の525 nmのフィルター。 YFPを測定するために、50分の525 nmのフィルターで488 nmのレーザー、キャプチャ蛍光で細胞を興奮させます。レーザーおよびフィルターの設定はさらに、表2に記載されています。
4. FRETとYFPチャネルにCFPスピルオーバーの補償を行います。
   注：補償は蛍光スピルオーバー補正する処理のことです。 1蛍光色素の蛍光発光は、フィルタデジ内で検出されたときに蛍光スピルオーバーが発生別の蛍光色素からの信号を測定するgned。適切な補償では、CFPの波及蛍光は、FRETとYFPチャンネルから削除することができます。
   注：報酬は、蛍光陽性と陰性細胞の両方の存在を必要とします。このように、CFP陽性細胞（細胞株＃2）、陰性細胞（細胞株＃1）に補償する前に実行するためにサンプルに追加する必要があります。
   1. よく細胞株＃2懸濁液200μlに、単一の細胞株＃1懸濁液の30μlの中でスパイクを補償する直前。
   2. 「機器の設定」アイコンは、「補償」タブをクリックし、補正テーブルを開くために「マトリックス」をご確認ください。
   3. CFP-二変量プロット対 FRET-Aを作成し、ステップ6.3で説明したように、ゲートP2を適用します。細胞株1 + 2動作している状態で、「象限」アイコンをクリックして蛍光陰性と陽性集団が低い2つの象限（ゲイツLL3 Aによって分離されるよう象限を描きますND。LR3、それぞれ）。
   4. LL3とLR3ゲートのためのFRETの蛍光強度中央値（MFI）が表示された統計表を作成します。 FRETシグナルのMFIがLL3とLR3の間で同等になるまで補償行列にFRETパラメータを調整します。このステップに続いて、FRETシグナルのMFIは、FRETチャネルにCFPスピルオーバーが存在しないことを示唆し、未染色細胞およびCFP陽性細胞の間で同じです。
   5. CFP-二変量プロット対 YFP-Aを作成し、ステップ6.3で説明したように、ゲートP2を適用します。ステップ6.4.3で行われたものと同様の象限（LL4とLR4）を描画します。
   6. LL4とLR4のためにYFPのMFIを表示する統計情報の表を作成します。 YFP信号のMFIがLL4とLR4間の等価になるまで補償行列にYFPのパラメータを調整します。このステップに続いて、YFP信号のMFIは、YFPチャネルにCFPスピルオーバーが存在しないことを示唆し、未染色細胞およびCFP陽性細胞の間で同じです。
5. Follゲートの設定と補償を起因して、関心のウエルを強調表示し、プレートの残りの部分を実行します。
6. すべてのサンプルの後、エクスポートデータファイルは、「コピー」、「ファイル」をクリックすることで、実行されています。 「データファイル」タブを選択し、実験のフォルダを選択し、「コピー」をクリックします。

7.データ解析

注：XまたはY軸のいずれかのタイトルをクリックし、適切なフィルタを選択することにより、個々の二変量プロットの変更軸パラメータ。

1. フローサイトメトリー解析プログラムで開くFCSファイル。
2. 散乱特性に基づいて、同様に第6節に記載されたものと、空のリポソームで処理した細胞から（FSC-A VS FSC-H）細胞集団（FSC 対 SSC）と一集団を定義する多角形のゲートを使用しています。
3. CFP補償がセットアップ時に実行された場合、さらにCFPを調整しないでください。
4. YFPの二変量プロット対 FRETを作成します。細胞株＃3を使用しました、FRET陽性細胞集団の斜面に沿って走る多角形ゲートを描くことによって偽のFRETゲートを定義します。このゲートは、FRETフィルター内の信号を発する単一YFP陽性細胞を除外し、そして以前ら禁止することにより示されたものと同様描かれている^。22
5. CFPの二変量プロット対 FRETに空のリポソームで処理したCFP / YFP細胞をプロットすることにより、FRETゲートを定義します。上向きと集団から離れて左に拡張し、人口の斜面に沿って多角形ゲートを導入します。このゲートは、ほとんどの細胞（〜99％）を除外する必要があり、その結果、バックグラウンドFRETは≥1細胞の％です。このゲートにシフトする任意のイベントは、FRET陽性と考えられています。
   注：上述の個々のゲートは、後続のゲートを構成する前に、すべてのサンプルに適用されます。分析に続いて、4つの個別のゲートが（;一;偽のFRET; FRET細胞集団）が定義されています。
6. パーセントのFRET陽性とM​​FI：含む関心のレコード解析パラメータ、FRET陽性細胞の。手動パーセント陽性とMFIの製品を測定することにより、統合されたFRET密度を計算します。
   注：統合FRET密度はアウトカム指標として使用される場合、セットバックグラウンドFRET（ステップ7.5で定義されている）およびMFI、その2つの個々の要素よりも少ない製品を計算回避するために1以上です。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBS	Sigma	T5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)	Roche	4693159001
Cryo-vials	Sarstedt	72.694.006
Analytical Balance	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml conical tube	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer	Omni International	18-000-115
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Noise Cancelling Ear Muffs	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
1.5 ml tubes	USA Scientific	1615-5510
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml Conical Tubes	Phenix Research	SS-PH15
25 ml reagent resevoirs	VWR	41428-954
Multi channel pipet	Fisher Scientific	TI13-690-049
96 well flat bottom plates	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 well round bottom plates	Corning	3788
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 Centrifuge	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003796
Hemacytometer	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Flow Cytomter	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo analysis software	Flow Jo
20 μl pipet tips	Rainin	GPS-L10
200 μl pipet tips	Rainin	GPS-250
1 ml pipet tips	Rainin	GPS-1000
200 μl pipet tips	USA Scientific	1111-1800
5 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-606180
10 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-607180
25 ml Serological pipett	Phenix Research	SPG-760180