フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

要約

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

要約

マウスの精子細胞の分化は、無傷のゲノムと機能的雄性配偶子の製造のための1つの重要なプロセスは、次の世代に伝達されます。これまでのところ、この形態転移の分子研究はその後の分析のために精子細胞分化のこれらの重要なステップの適切な分離を可能にする方法の欠如によって妨げられてきました。フローサイトメトリーを使用して、これらの細胞の適切なゲーティングでの初期の試みが原因クロマチンリモデリングを受けて精子細胞におけるDNA蛍光の独特の増加のために困難であったかもしれません。この観察に基づいて、我々は、エタノールで固定したマウス精子の4集団、核リモデリングプロセスに異なる状態を表す各の再現性精製を可能にする、シンプルなフローサイトメトリー方式の詳細を提供します。人口濃縮は段階特異的なマーカーおよび形態学的規準を用いて確認されています。精製された精子細胞は、ゲノムやプロテオームのために使用することができますIC分析します。

概要

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

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プロトコル

動物のケアは、シャーブルック大学の動物の管理と使用委員会に従いました。

1.チューブの準備

1. 細胞選別の前日には、5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブに熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）1〜2mlのを追加し、15ミリリットル、50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに。
   重要なステップ：プロトコルで使用されるすべてのチューブが被覆されていることを確認してください。
   注意：FBSコーティングは、管壁に付着する生殖細胞を防ぐことができます。
2. ゆっくりとチューブが均一に回転子を使用して被覆するために4℃での反転により、O / Nを混ぜます。
3. 翌日、デカントすることにより、コーティングされたチューブからFBSを削除します。
   1. *重要なステップ：5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブおよび細胞調製のために使用される15、50 mlチューブは、（プロトコルは2.11から2.1ステップ）完全にファニング（サイドストリームのすなわち、不正確な偏差）を防止するために、FBSを空にしていることを確認します。 FBSを削除するには、P200のピペットを使用してください。
      注：残留FBSチューブでソートする前には、細胞または細胞選別の際に使用される他の管の汚染の損失につながる可能性
   2. 精製された細胞を収集するために使用される下部チューブラウンド5ミリリットルポリプロピレンでFBSの小残留量（約100〜200μl）を残して下さい。

2.細胞調製

1. CO _2窒息続く（5％誘導はその後、2％に維持）、O ₂ /イソフルランを使用して麻酔下で1人の男性にマウスを生け贄に捧げます。
2. 消費税​​及び1.5ミリリットルチューブにバッファをソートする500μlの小さなハサミでカプセル開放を行う両方の精巣およびミンチ。
3. フラッシュ生殖最初切り捨て100-1,000μlの先端で1.5ミリリットルチューブで優しく上下にピペッティングにより精細管からの細胞、およびその後そのまま100-1,000μlの先端で。
4. 40μmのセルストレーナーを使用して、1つの濾過工程によって破片や塊を取り除き、50mlのコニカルチューブの前にろ液を集めますiouslyステップ1でFBSをコーティングしました。
5. 以前手順1でコーティングされた15ミリリットルコニカルチューブに合計3 mlの容量と転送ろ液までのバッファを並べ替えて、フィルタを1回洗浄します。
6. 0.8 mMのEDTAの最終濃度を得るために、細胞懸濁液（3ミリリットル48μl）を1ミリリットル当たり50ミリモルのEDTA pHが8の16μLを追加します。
7. 生殖細胞を固定するために、ゆっくりと乳白色の懸濁液が生成される穏やかな撹拌（低速でボルテックス）で10mlのピペットを使用して、氷冷100％エタノール3容量を追加します。
   重要なステップ：ゆっくりとエタノールを加え細胞調製物の完全性を維持することが重要と重要です。私たちは、エタノールの急速な添加は効率をソートの主な減少で得られた細胞溶解を引き起こすことを指摘しました。 3ミリリットルの細胞懸濁液は、エタノール9mlを約1分で添加されるべきです。
8. 反転による時々混合しながら氷上で15分間細胞をインキュベートします。
9. 5分間800×gで遠心し細胞懸濁液とクリアを削除上清。
10. 静かにバッファをソート2ml中の固定された生殖細胞を再​​懸濁します。
11. SYTO16 DNA色素（DMSO中の1 mM溶液）の4μlを添加して、（光から保護）は、少なくとも30分間インキュベートします。
    注：これは容易に精子細胞の高度に圧縮された核内に組み込まれる透過性DNA色素であるため、最高のソート結果をSYTO16を用いて得られます。

3.セルソーターを設定

注：ここでは、4-レーザー（405nmの - 紫、488nmの - 青、561 nmの - 黄緑色、633nmの - 赤）20パラメータBDFACSAria IIIセルソーターを用いています。 BD FACSDiva 6.1.3ソフトウェアは、データを視覚化し、分析するために使用されます。設定が使用ソータの種類に応じて変えることができます。

1. 選別前に流体のシャットダウン手順（ソフトウェアで「サイトメーター」メニュー）の間にシース液として70％エタノールを実行して、FACSソーターを滅菌します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体のshを選択。 "をutdownプロセスで述べた手順に従ってください。
2. 準備し、任意の結晶および汚染物質を除去するように、0.22μmのフィルターを用いて1×PBSをフィルタリングします。タンク内の上側の溶接線にシースタンクを埋めます。
3. ソフトウェアを起動し、ログインします。選別前に少なくとも30分間レーザーを温めるために、FACSソーターを開始します。流体工学からエタノールを洗い流すために、2つの流体起動プロセスを実行します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体の起動」を選択します。プロセスで述べた手順に従ってください。
   注意：これは、通常のシース液（1×PBS）で流体工学を復元します。
4. ブロックソート、蒸留水で偏向板をきれいにし、それらを徹底的に乾燥させます。超音波処理浴中で2分間蒸留水管に入れ100μmのノズルを超音波処理します。徹底的にノズルを拭きます。
5. フローセルに100μmのノズルを挿入し、12にノズルロックレバーを時計回りに回します時間位置。 20 PSIにシース圧を設定します。
6. ストリームをオンにして、周波数の目標値を取得するために振幅を調整（30前後）、ドロップ1（150前後）とギャップ（12前後）、安定した液滴切り離しパターン（数サテライト滴）を確立します。減衰をオフにします。
7. ストリームがストレートで、ソートブロックの角度を変更することにより、廃棄物の吸引器の中心に当たることを確認します。注：10 psiで130μmのノズルも試験したと明らかな差は見られませんでした。
8. 黄緑色レーザ用、青紫、赤のため-77.39、37.33および-39.85 0に設定レーザー遅延。
9. 黄緑色レーザ用、青紫赤1.0、0.75と0.96のための1.14へのスケーリング設定の領域。
10. （ソフトウェアの「サイドストリーム」ウィンドウ内の）試験ソートを使用して、サイ​​ドストリームがファニングされていないことを確認してください。彼らはmiddlを打つように、「サイドストリーム」ウィンドウでは、各副流の電圧スライダーを調整テストコレクションチューブのE。中央ストリームが固まっていない場合は、中央の流れを制限するために^、2位、3位、および4 ^{番目のドロップ}設定を調整します。
11. サイトメーターのセットアップとソフトウェアの追跡（CS＆T）アプリケーション（「サイトメーター」メニュー）を起動します。
12. 製造元の指示を使用して、サイ​​トメーターの性能の特徴付けおよび追跡を自動化するために、350μlのあたり1滴でサイトメーターセットアップおよび追跡ビーズを使用してください。
13. CS＆Tのアプリケーションを終了します。 CS＆Tの設定を適用し、ストリーム・パラメータがまだ安定した液滴切離しパターンを可能にし、（「切り離しウィンドウ」で）を、製造業者の説明書に記載されているようにスイートスポットボタンをオンにしてください。
14. 蛍光ビーズを使用してドロップ遅延値を最適化（材料の表を参照のこと）。
    1. ホルダーに収集チューブを取り付けます。ソートブロックのドアを開きます。 「サイドストリーム」ウィンドウで、「選択した電圧をオンにしますテストソート」と引き出しを開き、コレクションチューブにアクセスできるようにアスピレーター引き出しボタンをクリックします。
    2. 彼らは、チューブの中央に入るように、サイドストリームを最適化します。必要に応じて値スライダを調整します。
    3. ソートブロックのドアを閉じて、中央に明るいビーズスポットを得るために、マイクロメーターダイヤルを調整してください。選択を解除廃棄引き出し、テストの並べ替えと電圧。コレクションチューブを外します。
    4. 製造者の指示に従って降下遅延を最適化します。
       1. 簡単に説明すると、ビーズバイアルを激しく振とうし、PBS 0.5mlのビーズの1滴を希釈します。
       2. 製造者の指示を使用して、ソフトウェアで使用可能なドロップディレイ実験テンプレートを使用して、ドロップ遅延を設定します。また、ドロップ遅延を設定するには、[自動ドロップ遅延機能を使用しています。
       3. 蛍光ビーズのチューブをロードし、しきい値率が〜3,000〜4,000のイベント/秒になるまで流量を調整します。 「初期」と最後にソート精度を設定します。LY「ソートレイアウト」ウィンドウの「微調整」します。光学フィルタを選択して、ビーズを並べ替えます。 〜100％を左にソートされるまで、ドロップディレイを調整します。
          注：この手順は必ず側流への関心の種の細胞ことを確認することが重要です。ビーズと光学フィルタ100％滴偏差に近い達成するために使用されます。
15. FSC検出器ブロックの左端にFSC 1.5 ND（減光）フィルターを置きます。 （「サイトメーター」ウィンドウで、「レーザー」タブで）1.00に2.00マイクロ秒とFSCエリアのスケーリングにウィンドウの拡張機能を設定します。
16. サンプルチューブをロードする前に、凝集を避けるために、サンプルラインの最後に50μmのサンプルフィルタラインを配置します。これを行うには、「サイトメーター」メニューの「サンプルフィルタを変更」を選択します。
17. サイドストリーム間ファニングずに良好な分離を達成するために、試料流体の組成をテストしpolypropyleに付着する細胞を防ぐためにNEチューブ。
    1. サンプルチューブをロードし、偏向板をオンにして引き出しを閉じた状態で「テストの並べ替え」を選択します。分離はあまりファニングせずに発生した場合、サイドストリームを見てください。
       注：ファニング起因サンプル緩衝液中に高タンパク質濃度に思われます。
18. FACS装置にサンプルチューブをロードします。 300 rpmでのサンプルの攪拌と4℃の試料温度を選択します。 「取得ダッシュボード」の「データを取得」を選択します。
19. 必要に応じて、（3.0の最大流量で）5,000イベント/秒の最大値に適切なイベント・レートを達成するために、サンプルを希釈します。選別された細胞の純度を維持するように厳密にこれらの制限を尊重しています。
20. 分析し、細胞を選別するために、関心の集団に干渉することなく、破片を除去するためにFSC閾値を最適化します。対数目盛では、作るために530/30フィルタを備えた光電子増倍管（PMT）検出器の電圧を調整総人口の蛍光シグナルが陽性集団（ 図1、ゲート1）のスケールに収まると、ゲートことを確認してください。
21. SYTO16陽性集団の前方散乱面積（FSC-A）/側方散乱エリア（SSC-A）のプロットを生成し、約110 VリニアスケールでにFSC-Aを調整し、SSC-A約150 Vに非常に大規模な細胞および細胞凝集体を排除しながら、対数スケールですべてのイベントを可視化しました。
22. 「ソートレイアウト」ウィンドウで、「ソート精度モード」に設定」4ウェイ純度」に（収量マスク：0、純度マスク：32、位相マスク：0）。連続ソートのための「ターゲットイベント」メニューから「連続」を選択します。
23. （「ソートレイアウト」ウィンドウ）のチューブに対応するフィールドでソートする集団を追加します。高い真ん中の周波数と端部で低い周波数を持つものと集団を置きます。 、並べ替え中に2,500 Vに電圧プレートを設定し、サンプル収集トンを保ちます氷上ubes。

4.セルソーティング

1. すぐにソートする前に、丸底チューブを先にコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン50μmのフィルターを用いてフィルタセル。
2. バッファをソート1-2 mlの広範囲にフィルターを洗ってください。
3. 図1に詳述ゲーティング方式以下の488 nmレーザーを搭載したセルソーターを使用してソート固定生殖細胞は、以前に氷の上のセクション1でコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブ内の精製画分を収集します。
   1. FBSの100〜200μlのが管壁に選別された細胞の付着を回避するために、コレクションチューブに保たれていることを確認します。
   2. SYTO16の濃度が仕分け期間中に蛍光の変動を回避するために飽和していることを確認します。仕分けグラフィックでアレクサフルオロ488パラメータ（DNA染色）での細胞染色強度のさらなる変化がない場合SYTO16が飽和しています。必要に応じて、1μlを添加します飽和状態に達するまでの仕分けチューブにSYTO16。
   3. アレクサフルオロ488-A VSイベントの数：次のパラメータを表示し、グラフィック上の総イベントを表示します。
   4. 図1に示すように、ゲート1の正DNA染色細胞を選択します。
      1. パラメータとしてFSC-A対SSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1から表示セル
         1. 図1に示したように、ゲート2でセルを選択します。
         2. パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート2から表示セル。
         3. 図1に示したように、ゲート2のグラフィックの上にゲート5とゲート6とセルを選択します。
         4. パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックに表示され、別々にゲート5及びゲート6。
         5. 選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート5グラフィックと精子は、ゲート6グラフィックスに10-12精子細胞をステップに1-9精子細胞を繰り返します。
      2. 表示パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1からの細胞
         1. 図1に示したように、ゲート3とゲート4とのセルを選択します。
         2. パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックスの表示を別々ゲート3とゲート4。
         3. 選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート3のグラフィックと精子は、ゲート4のグラフィックに15-16精子細胞を、手順に13-14精子細胞を繰り返します。

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結果

フローサイトメトリーで使用されるゲーティング戦略

図1は、4つの高純度の精子細胞集団をソートするフローサイトメトリーに使用されるゲート戦略を表します。簡単に言うと、正のDNA染色を有する細胞（アレクサフルオロ488-A）が第1のサイズ対granulosity（SSC-A）を示すドットプロットで精子から1精子細胞は?...

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ディスカッション

精子形成細胞は常に精上皮の複雑さだけでなく、in vitro培養の限られた成功を与えて研究する挑戦されています。長年にわたり、様々な種から生殖細胞を精製するための多くの手法が開発されました。パーコールまたはウシ血清アルブミン勾配で重力を用いて沈降精製技術は通常、無傷の胚細胞の良好な収率を提供するが、このような減数分裂四倍体細胞および精子細胞¹⁰のよ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.