シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

要約

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。

要約

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

概要

近年中に、分子遺伝学的ツールおよびゲノムの広い範囲は、モデル種のシロイヌナズナで開発されてきました。この技術は、植物の開発が規制されている方法を理解する上で非常に進歩を促進してきました。モデルとしてシロイヌナズナを用いて研究し、発達過程の中で、開花時期の遺伝的制御が広範囲に解析されています。これらの研究は^、植物は非常に正確にそのようなホルモンや植物の年齢などの内因性手がかりに、また季節¹の自然なサイクルで開花時期を同期させるような日長や温度などの環境シグナルに応答して開花時期を調節することが示されています^2。開花の時間変化を有するシロイヌナズナ変異体の単離および特性は、内因性および環境要因に応じて開花時期を調節する遺伝子の複雑なネットワークを発表における決定要因となっています。これらの遺伝子回路は、開花のスイッチとして機能するいくつかのマスター遺伝子のレベルで統合され、花芽の正確なタイミングは、開花促進し、花のインテグレータ遺伝子^1,3の上流に働くの活動を抑制するのバランスに依存しています。

ゲノムアプローチの最近の使用によって支援開花開始の制御におけるその役割のために同定された遺伝子の機能解析は、開花時期の調節における転写制御の中心的な役割を明らかにしました。実際には、開花エンコード転写のマスター遺伝子の多くは^、4因子 。また、クロマチンリモデリングタンパク質複合体の数は、開花のマスター遺伝子の発現に影響を​​与えます。それらの変化した開花時のために単離さシロイヌナズナ変異体の数は、クロマチン修飾因子の様々なコード化する遺伝子に変異を有することが判明しました。ヒストンで翻訳後修飾を導入異なるクロマチン改築Eテール、ヒストンバリアントによって標準的なヒストンはシロイヌナズナ^5,6の開花の適切なレギュレーションのために必要であるDNAまたは交換する相対ヌクレオソームの位置を変更します。これらのクロマチンリモデリング活動のいくつかは、特定のヒストン残基におけるアセチル化やメチル化などの共有結合修飾の堆積または除去を触媒します。これらのヒストンマークは特に開花遺伝子の転写活性を調節するために、他のクロマチンリモデリング複合体、転写因子または転写機構の成分を補充する特殊なエフェクターによって認識されます。

クロマチン免疫沈降（チップ）は、目的のタンパク質のためのin vivoでの DNA結合部位の同定（ 図1）ことができます。この手順は、DNAに架橋タンパク質の特定の化学物質の能力を利用します。得られたDNA-タンパク質複合体は、次いで、特異的抗体AGAを用いて免疫沈降することができ選択したタンパク質に結合instの転写因子、クロマチン結合タンパク質、または特定の改変および異種エピトープ（一般に「タグ」と呼ばれます）。これらの免疫沈降物から精製されたDNAは、目的の特定の配列の濃縮のために評価するために定量的PCR（定量PCR）反応における鋳型として使用することができます。この方法では、転写因子の結合部位または特定の遺伝子でのヒストンマークの分布が^7,8を確立することができます。また、大規模並列シーケンシングを可能にする次世代シーケンシング（NGS）と合わせ、チップ​​技術は、転写因子の結合部位のゲノムワイドな識別だけでなく、ヒストン修飾の除幕式エピ風景を可能にしました。さらに、遺伝子発現の同時分析は、転写調節因子の結合または特定のヒストンマークの堆積は転写activiと相関方法をモニタリングできます遺伝子⁹のTY。

シロイヌナズナにおけるチッププロトコルの使用は、転写調節因子の様々な開花とどのようにこれらの構造変化は、遺伝子発現^{に影響を与える5,6}のマスター遺伝子のクロマチン組織に与える影響を評価することができました。以前の結果は 、短い日でシロイヌナズナ遺伝子座早期抽苔 （EBS）は 、この遺伝子のショーに開花し、開花FTのマスター遺伝子のアップレギュレーションの加速度を開花し、変異体のリプレッサーとして機能することを示しました。また、FTにおける機能喪失型変異は完全にFTが EBS変異体の早期の開花およびEBS ^10開花このマスター遺伝子の抑制のために必要であることが必要であることを示す、EBS変異体植物の初期開花表現型を抑制^{、11は、EBS} は、具体的には 、ヒストンH3のジ-に結合し、目にすることができるトリメチルPHDを含むタンパク質をコードしますFT ¹²のクロマチン媒介抑制におけるEBSの役割を示唆している電子のリジン残基4（H3K4me2 / 3）、。 ChIPのアプローチの使用は、シロイヌナズナPHD含有タンパク質EBS ^10,11は、その発現^12を抑制するために花のインテグレータ遺伝子FTの調節領域に結合することを実証しました。チップ技術の使用によって得られる追加のデータは、このタンパク質は、シロイヌナズナの開発の初期段階で開花のこのマスター遺伝子のクロマチンにおけるヒストンアセチル化、活性な転写の顕著な特徴の低レベルを維持するために必要とされることを示しました。一緒に、遺伝子および遺伝子発現データを有するこれらの観察は、このシロイヌナズナPHD含有タンパク質は、花の積分FT遺伝子¹²の発現を調節することにより、開花時間の微調整において中心的な役割を有していることを示しています。ここで紹介する作品は、ヒストンの分析のためだけでなく、他のためだけでなく、有益な最適化された方法を提供し、タンパク質、および効率の向上と低下し、実験時間に関連するクロマチン。また、この報告書は、チップ・プロトコルの使用は、クロマチンの修飾の変化や植物遺伝子の転写状態、およびシロイヌナズナの開花の発症に遺伝子発現制御への影響をどのようにこれらのクロマチン媒介機構との関係に新たな洞察を提供している様子を示しています。

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プロトコル

植物材料の1架橋（1時間）

1. シロイヌナズナの実験に用いたライン成長（ - WT - 野生型変異体対を、および/またはタグを表すライン対目的のタンパク質のタグ付けされたバージョンを表す線は、任意のタンパク質を融合していない）大きなペトリ皿に12-18日間（150 mm）のMS寒天培地（1 L：1×ムラシゲ・スクーグ塩、10gのスクロース、0.5グラムのMES、pHを5.7（KOH）、1％寒天）。土壌やバーミキュライトの1ミックス：別の方法として、3を含む鉢に植物を育てます。
   注意！ホルムアルデヒドは皮膚に接触し、飲み込む、吸入による毒性があり、かつ、適切な個人用保護具を着用し、化学フード内で処理する必要があります。 1.2手順 - 1.6はヒュームフードの下で実行する必要があります。
2. 実験室のバーナー加熱針を用いて50 mlチューブの蓋に小さな穴を作ります。 1％の最終濃度になるように1×PBS 40mlの緩衝液追加の1.08 mlのホルムアルデヒド（37％ストック秒olution）。これらの50mlチューブに植物材料の1.5グラムを収集します。架橋の間にチューブを氷上に保管してください。
3. 蓋を用いて50 mlチューブを閉じます。デシケーターにチューブを配置し、真空を適用します。真空は、ソリューションをかき回す防止するために、慎重に真空を解除した後、10分間の組織に潜入。サンプルを混ぜます。二回繰り返します。浸透後、植物材料を観察し、それがわずかに半透明になっていることを確認し、チューブ（ 図2）の底に沈む傾向にあります。
4. 5分間真空を適用する0.125 Mの最終濃度を達成するために2 Mグリシン2.5mlのを追加します。グリシンは、ホルムアルデヒド架橋の競合的阻害剤として機能します。
5. 蓋の穴と、閉じた50mlのチューブを反転させ、PBSホルムアルデヒド - グリシンソリューションを捨てます。
6. 1×PBSで2回苗木をすすぎ、一度ステップ1.5で説明したように水が洗浄溶液を廃棄しています。ペーパータオルの上にそれらを乾燥させ、液体nitrogeに凍結N。
   注：凍結組織は、数週間のために-80℃で保存することができます。

抗体の調製（1日）

注：免疫沈降のために、タンパク質Gまたはタンパク質抗体の重鎖の定常ドメインのための高い親和性を有するリンカーを介して抗体と結合させた磁気ビーズを使用することが推奨されます。 DNA-タンパク質複合体は、ビーズ - 抗体複合体の表面に非特異的に接続することができます。そのため、非特異的バックグラウンドを定量化するために特異的な抗体なしのコントロールを行う必要があります。

1. 各免疫沈降のために1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の磁気ビーズの15μlのを準備します。ビーズの量は、免疫沈降のために、また、抗体上で使用されるクロマチンの量に依存します。
2. 、洗浄ビーズにクロマチン免疫沈降（チップ）の希釈緩衝液1mlを追加し、回転させることにより混合し、1.5ミリリットルの微量TUを配置するには磁気ラックになります。ビーズが磁石に付着させるために約1分待ちます。まだラック1.5 mlマイクロチューブを使用すると、ピペットで上清を除去します。二回繰り返します。
   注：各植物系統の場合は2免疫沈降セットが必要とされている：ビーズと抗体（Ab）を持つ唯一の磁気ビーズを有する第二抗体なし（無AB）コントロール。
3. ChIPの希釈緩衝液200μlでビーズを再懸濁します。 （正確な希釈は、各抗体のために異なり、実験的に最適化されなければならないか、市販の抗体の場合には、製造業者の指示に従ってください）​​各植物系統のために調製した2つの管のいずれかに特異的Abの必要な量を追加します。免疫沈降のために、このサンプルを使用してください。ネガティブコントロールとして使用される他のチューブへの非特異的IgGの同じ量を加えます。
4. 抗体はビーズに付着させるために4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。

3.クロマチン抽出（4時間）

1. 粉末が均一とライトグリーンになるまで乳鉢と乳棒を用いて徹底的に液体窒素中で凍結した植物材料を粉砕します。新しい50mlチューブに粉を転送します。
2. 手順3.2 - 3.6、ヒュームフードの下で働きます。抽出緩衝液1（のExB 1）の30ミリリットルを追加し、組織粉末を浸してよく混ぜます。上のこの段階で、すべての回で、4℃でサンプルを保ちます。凍結組織と液体窒素残り物は、バッファがフリーズする原因となります。チューブを4-5回2分毎に反転させることにより、完全に凍結組織を解凍してください。
3. 4℃で20分間、1000×gで新しい50mlのチューブと遠心分離機にに22〜25ミクロンの孔サイズを有するろ過組織を通過させることにより、スラリーをクリアします。
   注：このステップでは、核とすべての細胞小器官は、ペレット化されます。 ExB 1は、高密度を提供し、細胞小器官の構造の破壊を防止するのに十分なショ糖が含まれています。
4. 静かにデカンテーションにより上澄み液を除去します。この駅でGEは、約2 mlと緑のペレットを観察します。
5. ExB 5ml中のペレットを再懸濁ペレットの再懸濁2は、この時点では困難になります。 4℃で10分間1,000×gで遠心分離します。
   注：のExB 2が開いて葉緑体を破裂助け、クロロフィルを除去するために、1％トリトンX-100が含まれています。
6. 抽出緩衝液3（のExB 3）300μlの中にペレットを再懸濁。
7. きれいな微量遠心管では、ステップ3.6から再懸濁したペレットを取り、慎重にきれいなのExB 3の上に層3のExBの600μlを添加します。
8. 4℃で16,000×gで1時間スピン。
   注：この手順は、サンプルから界面活性剤を除去することができます。
9. ピペットで吸引することにより、上清を取り除きます。ゆっくりと超音波処理の効率に影響を与える可能性がある、泡の形成を避けるために、上下にピペッティングにより超音波処理バッファー300μlの中で核ペレットを再懸濁します。慎重にすべてのサスペンションをピペットと新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。
   注：このバッファは、核を溶解し、クロマチンを解放するために、SDSが含まれています。
10. 核を溶解し、ランダムに小さな断片にクロマチンをせん断するサスペンションを超音波処理。 （材料/試薬の表に記載され使用可能な超音波処理装置4℃で設定30秒ON / 30秒OFFで20〜30サイクル）を200〜800塩基対の間の断片が濃縮されたクロマチンをレンダリングする超音波処理条件を使用してください。超音波処理クロマチンの2μL（ 図3）をロード 、アガロースゲル¹³で得られたDNA断片の電気泳動分離によって、超音波処理の効率性を確認してください。
    注意！超音波装置は、防音キャビネット内に含まれていない場合には、超音波処理工程の間に耳の保護具を着用することを確認します。
    重要なステップ！クロマチンの断片化は、主に超音波処理装置に依存します。超音波処理条件は、適切なDNAサイズの濃縮を達成するように調整されるべきです。見るクロマチンの断片化を最適化する方法の例については、図3。
11. 4℃で10分間12,000×gで一度ソリューションをスピン。新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで上清を転送します。ペレットを廃棄します。 -20℃で入力し、凍結としてマークし、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清の1/10を取ります。
12. 0.1％の最終濃度までSDSを希釈するためのChIP希釈緩衝液で10倍に希釈するクロマチン。
    注：サンプルは、数週間凍結させ、-20℃で保存することができます。

目的のタンパク質とDNAの救助の4免疫沈降（1日、3時間）

1. ステップ2.2で説明したように、過剰の抗体を除去するためのChIP希釈緩衝液1mlで3回ステップ2.4​​からAbでコーティングしたビーズを洗ってください。 ChIPの希釈緩衝液200μl中に再懸濁します。分離されたクロマチン50μlのを追加します。 4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。
   注：concentratiをチェック微量紫外可視分光光度計でのクロマチンの上。分離されたクロマチン50μlのDNAの10以上のμgのを含める必要があります。
2. 4℃のステップ4.2から4.5までの仕事のために。ステップ2.2で説明したように低塩洗浄緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。
3. 高塩洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。
4. LiClを洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。
5. TE緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。最後の洗浄後、完全にピペットで吸引してチューブ内に残されたTE緩衝液を除去してください。
6. 入力サンプル（ステップ3.9）を取り出します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移し、INPUTの5μLを、チップのサンプルのように続けます。 5％のキレートイオン交換樹脂の200μLを添加することにより架橋逆転、すべて2~3分間振盪し、95℃で10分間インキュベートします。 30秒間16,000×gでスピンダウンし、注意深くピペッティングにより新しいマイクロチューブに上清を移します。
   注：TRAながら反転の架橋ditional方法は、したがって、プロトコル一日短くなって、効率的な脱架橋および10分でのDNAの溶出を可能にするのNaCl、95℃でのキレートイオン樹脂とのインキュベーションでのO / Nインキュベーションすることを含みます。
7. プロテイナーゼK（10mg / ml）を2μlを添加し、タンパク質を消化し、DNAを放出するために、37℃で30分間インキュベートします。
8. 10分間95℃でインキュベートすることによって反応を停止させます。
9. すぐに30秒間16,000×gでスピンし、ピペッティングにより上清を新しいチューブに移します。
10. DNAをきれいに標準的なDNA断片を精製キットを用いて単離しました。
    注：製造元の指示に従って進んでください。
11. 新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにキットからのDNA結合列を転送します。列の中央にDNアーゼを含まない水20μlを添加し、60秒間16,000×gで回転させて精製されたDNAを溶出します。ポイントを停止し、試料を数週間-80℃で保存することができます。

5.定量PCR（4時間）によって免疫沈降したDNA中の結合部位の存在量を測定します

注：沈殿クロマチンから分離されたDNAは、その関心のあるタンパク質に結合し、総クロマチンからのChIP-EDされたDNA断片を決定するために分析されなければなりません。

1. 60℃の融解温度（Tm）は、30％-80％のGC含量を有する関心のあるゲノム領域の設計プライマー。クロマチンを超音波処理によって断片化されているように、増幅された配列の長さは150〜200ヌクレオチド（ 表1）よりも長くてはなりません。
   注：プライマー設計のための有用なツールは、プライマー3プログラム（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）です。プライマー設計のための追加のガイドラインは以前の報告^8、14,15でご利用いただけます。
2. プライマーが特異的であることを確認してください（特にプロモーターは同様のTF結合配列を共有することができます）とプライマー効率のusinを​​テストするためにBLASTプログラムを使用してくださいGインプットDNA（ステップ4.9）の水で1:10希釈液。ゲノムの特定の領域は、他のものより優れて精製されます。これは、PCRプライマーを設計し、希釈された入力DNAにそれらを確認することが重要です。
3. 各反応のためのPCRチューブに水とピペットで希釈したDNAの5μLを精製されたDNA 1:10に希釈します。
   注：DNAを1.5 mlマイクロチューブの壁に取り付けることができますように、必要な量だけを希釈します。複数の融解凍結サイクルが添付されたDNA分子の数を増やします。各プライマー対は、入力での増幅のために、抗体チップと無抗体チップを分析する必要があります。
4. PCRミックスを完了するために、1×最終濃度のSYBR Green PCRマスターミックスを追加し、各プライマー0.5μM。 DNアーゼを含まない水で20μlに埋めます。
5. SYBRグリーンPCRマスターミックスの製造業者の指示に従って定量PCR反応を実行します。

6.データ解析

注：元のうち、ChIPのデータを分析する方法をisting二つの最も一般的に使用されます。それらの最初のも、「無抗体対照に対して ''相対的濃縮」、「バックグラウンドを超えるシグナル」またはという名前の倍の濃縮方法です。第二の方法は、「入力の％」と命名されます。

1. 倍の濃縮法によるデータ解析。
   1. サンプル名および定量PCR反応後に得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。
   2. 各サンプルについて、その生のCt値から、対応する無Abの制御のために得られた生のCt値を差し引きます。注：この数学的な操作の後、無抗体サンプルのCt値が0に等しくなります。
   3. ベース2とステップ6.1.2（ 表2）で得られた負の剰余に等しい指数（パワー）で指数演算によって倍の濃縮を計算します。
      濃縮を倍= 2 ^{- （CT（サンプル） - CT（無AB））}
      注：このメトでDのChIP-EDの試料中の特定のDNA断片の存在量は、無抗体コントロールでこのフラグメントの豊富と比較されます。この方法の前提は、バックグラウンドシグナルのレベルが異なるプライマーセット、サンプル、および複製の実験の間に再現性があることです。しかし、この'noise'信号レベルは、プライマーセット、サンプル、実験の間で変化しません。
2. 入力方法の何％でデータ分析。
   1. サンプル名および定量PCR反応後の彼らのために得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。
   2. 入力とした総抽出クロマチンの画分から対数の底2の値を減算することにより、入力サンプルの生Ct値を調整します。
      注：合計クロマチンの10％は、このプロトコルで入力としたように、このプロトコルでは減算値は、3.32に等しいです。ログイン_2（10）は3.32に等しいです。
   3. 100でBと指数演算の値を乗算することにより、入力の％を計算します2アーゼサンプル（ 表3）の生のCt値から減算調整された入力値の残りの部分に等しい指数（電力）。
      入力の％= 100 * 2 ^{（調整された入力- CT（サンプル））}
      注：この手順で、総孤立クロマチン（入力サンプル）へのChIP-EDの試料中の特定のDNA豊富との関係を計算します。チップデータの分析に関するさらなる詳細は、ヘリングらに記載されています^。8。

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結果

エイト主な手順は、成長し、植物材料、クロマチンの架橋、クロマチン分離、クロマチンの断片化、DNAとの間の複合体の選択的単離の収穫など、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用の同定のために、このチッププロトコルに白羽することができます免疫沈降、タンパク質の消化、DNA精製、およびqPCR分析による目的のタンパク質（ 図1）。 ChIPプロトコルにおける重要なステッ?...

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ディスカッション

ここで説明のChIPプロトコールは、タンパク質およびアラビドプシス植物の in vivo での特定のDNA配列間の相互作用を分析するための再現可能かつ強力な技術です。目的のタンパク質の結合部位の同定に成功し、関連する相互作用が実際に行われている植物器官や発達段階を適切に選択する必要があります。また、植物材料の適切な固定および超音波処理によりクロマチンの最適な...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Sigma	M8250
MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)	Sigma	M5524
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25	Use under the fume hood
Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche	5892791001
Bioruptor Standard sonication device	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
Glycine	Sigma	50046
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G	Life Technologies	10003D/10001D	Check manufacturer’s manual for antibody affinity
Miracloth	Merck Millipore	475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	85112
(mouse, rat, rabbit…)-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
Magnetic rack - DynaMag-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium	Diagenode	C15410200-10
Chelex 100 Resin	Bio-Rad	142-2832
Proteinase K	Life Technologies	17916
Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6	Millipore	05-724
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001