可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

要約

このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。

要約

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

概要

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

プロトコル

苗の調製

1. 種子を滅菌します。
   1. 1μlの10％トリトンX-100〜500μlの滅菌水：500μLのNaClO（5.0％有効塩素）を加えることによって滅菌溶液を調製します。
   2. 場所の約 10 形質転換A. 1.5 mlチューブに、GFP-PATROL1 ^8を運ぶ シロイヌナズナの種子。
   3. 1ミリリットルの70％エタノール溶液を追加し、5回反転させてよく混ぜます。 1分間のままにしておきます。
   4. 種子は、チューブの底に沈む確認します。クリーンクリーンベンチでは、静かにマイクロピペットを用いて70％のエタノールを除去し、1ミリリットルに滅菌溶液を添加。 5回反転させることによって十分に混合し、5分間放置します。
   5. 種子を洗ってください。それでもクリーンベンチに無菌状態の下で働いて、静かにマイクロピペットを用いて溶液を除去し、1ミリリットルに滅菌水を追加します。この5回繰り返します。滅菌種子は、2日間4℃で滅菌水に格納されてもよいです。
2. だから、0.5％ジェランガム固化1/2ムラシゲ・スクーグ培地プレート（pHは^5.8）9の滅菌種子ワットサージカルテープの二つの層を用いてプレート上にふたをテープで固定します。
3. 冷蔵室、O / Nで、4℃で暗所でプレートをインキュベートします。
4. 100マイクロモルメートル^-2秒 -1白いライトを使用して12時間/ 12時間の明暗サイクルで23.5℃に設定し、成長チャンバ内にプレートを移し、7日間インキュベートします。長い1mm程度の子葉と苗木は、その後収穫することができます。

2.スカイドロップ子葉片の取り付け

注：VAEM観察用の試料の調製における重要な要因は、試料とカバーガラスの間に気泡の混入を回避されます。気泡が大きく屈折率の差を生じさせることによってVAEMの画質を低下させます。我々は、「空のドロップ」と呼ばれている単純な実装方法は、気泡を回避するために使用することができA.間のシロイヌナズナ子葉とカバーガラス。これは、観測の直前に行​​われる必要があります。

1. 76：スライドガラス（サイズの中央に基礎緩衝液30μl[5 mMの2-（N-モルホリノ） -エタン酸トリス（MES-トリス）pH6.5で、50mMの塩化カリウム、100μMのCaCl _2]を配置します×26ミリメートル、厚さ：1.0〜1.2ミリメートル）。
2. 解剖ハサミを使用して、7日齢の苗から子葉を削除します。観察側が基底バッファ降下（ 図1、ステップ1）上に向けて子葉をフロート。
3. カバーガラスの中心に基礎緩衝液30μlを置き（サイズ：18×18ミリメートル、厚さ：0.12〜0.17ミリメートル）（ 図1、ステップ2）。逆さまに静かにカバーガラスを回します。表面張力が脱落バッファ低下を防ぐことができます。一方の縁部にピンセットでカバーガラスを保持します。バッファ降下は約子葉の上にあるように、スライドガラス上に反対側の端を置きます。
4. それは子葉試料（ 図1、ステップ3）の真上になるように、スライド上の静止カバーガラスのエッジ、まだピンセットで反対側の縁部を保持して、カバーガラスの下にバッファのドロップの位置を調整します。カバーガラスを手放します。気泡のない準備で得られた試​​料のドロップをマウントします。
5. 糸くずの出ない組織を使用して余分なバッファを拭き取ってください。すぐに準備を観察し（ステップ3を参照）。
   注：サンプルをシールする必要はありません。

3. VAEM観察ムービー取得

倒立顕微鏡はTIRFユニットと1.49の開口数とTIRF対物レンズを搭載しています。注：以下のように本研究で使用するTIRF顕微鏡システム^{9について説明します} 。レーザー入射角のコンピュータ制御は、制御ボックスが使用されます。緑色蛍光タンパク質（GFP）は、488nmの光励起半導体レーザで励起され、そしてt彼は、蛍光が葉緑体の自己蛍光を防ぐために、510から550 nmのバンドパスフィルタを介して検出されます。ファイバ出力電力の測定された最大値は13.0から13.5ミリワットです。検出のために、電子増倍電荷結合素子（EM-CCD）カメラヘッドシステムとCマウントカメラ倍率変更手段が使用されます。

1. 製造元の指示に従ってを中心と集光レーザーを調整します。
   注：この手順は、正確なVAEM観測のために重要です。それは強くレーザー経路の調整手順の定期的なチェックは、あなたの顕微鏡に応じて、実行することをお勧めします。
   1. 顕微鏡室の天井に対物レンズのない光路で照射中心位置を決定します。中央の位置をマークするには、天井に色付きの円シールを置く（ 図2、ステップ1、2）。
   2. 対物レンズ（ 図2、ステップ3、4）で天井を照らします。私を移動します中心位置（ 図2、ステップ5）に地域をlluminated。レーザー（ 図2、ステップ6）フォーカス。微調整の中心に集光されたレーザ（ 図2、ステップ7）の位置。
2. 顕微鏡のステージ上の試料をセットし、明視野照明を使用して観察するためのセルを選択します。
3. 蛍光タンパク質は、細胞で観察することができることを確認し、落射蛍光照明（ 図3A）を用いて細胞表面でのz -軸位置を設定します。
4. VAEM観測を行います。
   1. コントローラボックスで徐々にレーザービームの入射角を傾け。同時に、慎重にライブ映像を監視します。最初は、イメージが（ 図3B）ぼかされます。
   2. レーザー角が増加するにつれて、VAEM画像は最終的には鮮明な画像（ 図3CおよびD）を製造する 、より少ない不鮮明になるであろう。この時点で、increaを停止レーザー角度を歌います。蛍光信号が失われた場合、より浅い角度に減少します。
   3. 微調整のレーザー入射角は、より良好な画像を得ることができます。 Z -軸の位置の微調整は、画像を改善することができます。必要に応じて、光学パラメータ（レーザー出力、波長フィルタセット）を調整し、画像センサパラメータ[画像サイズ、露出時間、ゲイン、デジタイザと電子増倍（EM）ゲイン]。
      注：以下のように上述のTIRF顕微鏡装置の場合には、代表的なパラメータです。ちょうどカメラの前でレンズの倍率：2倍。レーザー出力：1.0 mWの。画像サイズ：512×512ピクセル。露光時間：100ミリ秒。ゲイン：5×を。デジタイザ：11 MHzの。 EMゲイン：100。
5. 商用顕微鏡ソフトウェアを使用して、複数ページのTIFF画像ファイルとして映画を取得します。ここでは、映画は、気孔細胞の表面上の点滅GFP標識されたドットです。
   注：代表画像取得条件はFOLの通りであります安値。取得モード：ストリームは、RAMに。フレームの数：600;マルチページTIFFファイルサイズ：〜302メガバイト

フィジーソフトウェアを使用したGFP標識ドット滞留時間の定量化のための4カイモグラフ分析

1. 著者の命令（http://fiji.sc/Fiji）を使用して、フィジー（ 'フィジーはちょうどImageJのである'）ソフトウェア^{10をインストールします} 。
2. フィジーを実行し、フィジーメニュー「 ファイルを開く」を使用して取得したマルチページTIFFファイルを開きます。
3. フィジーツールバーメニュー「 直線選択ツール」を使用して 、目的の部位に線を配置します。必要に応じて、「 セグメント化されたライン選択ツール 」または「 フリーハンドライン選択ツール」を使用します。ここに提示した結果では、100ピクセル（8.0ミクロンに相当する）の直線を子会社細胞（ 図4A）の上に置きました。
4. フィジーメニューの 「画像・スタックダイナミックResliceを使用してカイモグラフイメージを作ります "（http://fiji.sc/Dynamic_Reslice）（ 図4B）。カイモグラフイメージで必要に応じて、「垂直フリップ 」とチェックボックスウィンドウで「90度回転」も（ここで提示された結果では使用されません）があり、x軸とy軸線位置に対応する（100画素を示しそれぞれ8.0μm）とし、観測時間（600ピクセルが60秒に相当）、。カイモグラフイメージが満足できない場合は、複数ページの画像上の線の位置と種類は（ストレート、セグメント化され、フリーハンド）のよう。変更することができますラインの変更、カイモグラフイメージが動的に変化します。フィジーメニュー「ファイルとして保存-TIFF」を使用して、TIFFファイルとしてカイモグラフ画像を保存します。
5. 時間軸の向きにブロブの長さを測定します。
   1. ノイズリダクションを実行するには、フィジーメニュー「 プロセス・フィルタ-ぼかし（ガウス）」を使用してカイモグラフ画像にガウスフィルタを適用します。 「 シグマ（ラッドIUS）」パラメータが調整可能（1ピクセル半径が提示された結果のために使用される）です。
   2. セグメントフィジーメニューを使用して、しきい値による信号領域、「イメージ・調整・しきい値を 」。
      注：選択可能ないくつかの閾値化アルゴリズムがあります。提示された結果では、「円」のアルゴリズムは、（ 図4C）を選択しました。
   3. メニューを使用してブロブの-軸の長さを時間（y）を測定するための準備」 を分析・セットの測定を 」。 「 セット測定」ウィンドウの「 境界の矩形」を確認してください。理想的には、領域セットは、ノイズを排除するために、可能な限り小さくすべきです。ここでは、最小面積は50ピクセルに設定しました。時間（y）を測定し、メニュー「 分析・解析粒子」を使用してブロブの長さを-axis。結果の値を取得し、測定領域の信頼性を証明するために、「 結果の表示」をチェックし、「Managerへの追加</ em>の "ボックス。
   4. 「 高さ 」の欄の値は、（y）が測定されたブロブ（ 図4D）のための長さを-axis時間です。結果テーブルメニュー「ファイルとして保存」を使用して値を保存し、計算し、統計パッケージ、および/ ​​または表計算ソフト（ 図4E）を使用してブロブ画像期間のデータセットを処理します。

結果

このビデオの記事では、Aの GFP-PATROL1のVAEM観測のためのプロトコルシロイヌナズナ子葉気孔複雑な細胞が提供されています。空ドロップ実装はA.のVAEM調製物中の気泡の発生を減らすことができ、簡単な製造方法でありますシロイヌナズナ子葉（ 図1）。エントリーレーザーおよび/またはVAEMのための検体のz位置決めOvertiltingは不明画像を提供します。そ?...

ディスカッション

このビデオの記事では、プロトコルは、 シロイヌナズナの気孔複合体上のGFP-PATROL1ドットの動的挙動を監視し、測定するために与えられています。ここに示されているように、VAEM観測は、植物の細胞表面のライブイメージングのための強力なツールです。高感度EM-CCDはVAEM光学系では比較的弱い励起レーザの使用を可能にするため、GFP-PATROL1の監視のためにここに使用した実験条件下で...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)