小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単​​な方法

要約

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

要約

環境水サンプルの固相抽出（SPE）のための新たな方法が提案されています。開発されたプロトタイプは、コスト効率的でユーザーフレンドリーであり、迅速な自動化と単純なSPEを行うことができます。プレ濃縮液は、低有機溶剤の含有量を、免疫測定法による分析と互換性があります。この方法は、100 mlの水サンプル中の天然ホルモンの17βエストラジオールの抽出及び予備濃縮のために記載されています。逆相SPEは、オクタデシル - シリカ吸着剤を用いて行われ、溶出はメタノール50％v / vの200μlで行われます。溶離液は、メタノールの量を低下させるために脱イオン水を添加することによって希釈されます。手動SPEカラムを準備した後、全体的な手順は、1時間以内に自動的に行われます。プロセスの終わりには、エストラジオール濃度は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定されます。 100倍のプレ濃度が達成され、わずか10％v / vの中のメタノール含有量。分子の完全な回復1 ngので達成される/ Lは、脱イオン化された合成海水サンプルをスパイクしました。

概要

サンプル調製は、任意の分析のプロセスの重要なステップです。具体的には、マトリックス効果、干渉の減少、および分析物の濃縮の除去は、正確な結果を得るため、検出の下限に到達するために必要です。内分泌かく乱化合物（のEDC）による生物に対する作用に特に懸念た場合であっても、環境が非常に低いレベルで存在します。天然ホルモン17βエストラジオールは、EUの水質汚染の監視リスト上に存在し、欧州の水枠組み指令で規制優先物質のリストに追加されやすいです。固相抽出（SPE）は、一般に、化学^1-5（クロマトグラフィー、質量分析法）及び免疫^6-9検出方法の両方で、水の小さな汚染物質の分析に適用されます。後者は、イムノアッセイは、フォーマットの多種多様で利用可能であるTAに固有のものとして、環境モニタリングの分野に関心を得ました目標確認検体、検出の下限に達した^{。6、7、10、11、}種々の酵素免疫測定法（ELISA）は市販されており、マルチウェルプレート上で一度に複数のサンプルを分析するために使用可能に連結されました。手続きには数時間かかることがあり、連続反応工程で構成されています。反応の最終生成物は、検量線に基づいて、標的分子の濃度を決定するために、光学的に検出することができます。

クラシックSPE手順は、吸着剤プレコンディショニング、サンプル抽出、洗浄、溶出、および溶離液の蒸発による濃縮を含みます。この抽出物の希釈のために使用される溶媒は、検出方法に応じて選択されます。免疫学的方法については、強く、有機溶媒の影響方法の感度の量^。12

回復及び予備濃縮性能に加えて、この方法は、簡単かつコスト効率的である必要があります。 procedurの自動化eは人間関連のエラーを削減することができます。私たちの以前の研究¹³では、自動化されたSPEのためのプロトタイプを導入し、私たちの方法は、海水試料中の天然ホルモンの17βエストラジオールの分析に適用しました。現在の映像で、私たちは、オフラインの伝統とオンラインSPE、および免疫反応による検出とその特定の互換性に比べて提案手法の技術的な利点を強調したいと思います。我々は、17βエストラジオールの検出のための水サンプルに適用プロトコルを記述する。 SPEは、オクタデシルシリカ（C18）吸着相と溶出を希釈メタノールを用いて行われると実行されます。

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プロトコル

注意：以下のプロトコルは、SPEが50％（v / v）のメタノールで18の吸着剤および溶出で100mlの水のサンプルに対して行う説明します。酵素免疫測定法（ELISA）キットを用いて連結された濃縮されたサンプルは、分析前に10％（v / v）のメタノールに達するように希釈されます。

1.試薬の準備

1. 水サンプルを準備
   1. 他のステップの前に、0.2μmの孔径のフィルターを各100 mlの水のサンプルをフィルタリングします。
   2. 水の量に参照溶液の適切な量を希釈することにより、所望の濃度でサンプルをスパイク。例えば、300μgの/ Lの濃度のE2参照溶液の3.3μLを希釈することにより、E2の100 ngの/ Lの水サンプルを100mlを調製します。 10 ngの/ L E2をスパイクサンプルを得るために、このソリューションを10回希釈します。 1 ngの/ L E2で100mlのサンプルを取得するために、この後者に別の10倍希釈します。
   3. Gでガラス瓶にろ過した試料（未修正またはスパイク）を配置L45スレッド。同じ日にサンプルを使用してください。初期濃度を推定するためにELISAを用いて分析する小さな部分を取ります。
2. タイトなチューブに50％v / vのに脱イオン（ジ）を水にメタノールを希釈することにより溶離液の300μlのを準備します。

SPEカラムの調製

1. 最初のメタノールの1,600μL、次いで逆相吸着剤の40 mgのジ水400μLを加えることによって、オクタデシル - シリカ吸着剤粒子の20 mg / mlの懸濁液を調製。しっかりと蓋を閉め、ボルテックスで攪拌します。
2. 列の一番下の膜のインストール
   1. 細孔径11ミクロンと1ナイロン膜を選択し、防塵組織の二重の層の上に置きます。直径3mmのパンチで、膜中に二つの小さな部分をカット。
   2. フラットエンドフィルタのピンセットで小さな膜のいずれかをつかみ、列の一方の側に配置します。
   3. チューブを平底コネクタをねじ込み、締めます。膜はnですOW、所定の位置に吸着剤を確実に加えることができます。膜が配置された端部に向かって列のポインティングの身体の矢印を描画します。
3. パックされた吸着剤カラムの準備
   1. 底部に向かって矢印をホルダーに列を固定します。列には、できるだけ垂直に設定する必要があります。
   2. ルアーロックコネクタを使用して、列のチューブの端部に空の10ミリリットルを使い捨て注射器を取り付けます。
   3. 20-200μlの先端にマイクロピペットを準備し、100μlにボリュームを設定します。このピペットチップのフォーマットを調製するための吸着剤カラムのサイズに適合されます。手順は、1ミリリットルピペットで使用されるものと大きなピペットチップで、より困難であろう。
   4. ボルテックスで吸着剤懸濁液を攪拌し、急速に列を中心に100μLをピペット。注入しながら、吸引優しくすべてのピペッティングソリューションは、もう一方の手で注射器を使用することにより、膜の谷。このSTで年齢は、シリンジの充填溶液は、粒子の明確でなければならず、粒子床は、結局は列で観察することができます。
   5. 溶液中の粒子の均一な懸濁液を確保するために、すべてのピペット操作の間にストック懸濁液を撹拌することにより、このプロセスをさらに2回繰り返します。結果の列は、吸着剤の6ミリグラムが含まれています。
   6. 懸濁液の300μlのがロードされ、注射器で吸引することにより、乾燥された場合には、位置に注射器を保持し、もう一方の手で鉗子を使用して上に第二のナイロン膜を配置します。
   7. チューブと第二のコネクタをネジ止めし、注射器を廃棄してください。 SPEカラムを使用する準備ができました。

3.システムの準備

1. ルアーロックコネクタを使用して、デバイス上のSPEカラムを締めます。矢印は、デバイス上に示したものと同様の方向を指している必要があります。
2. ねじ込むことによって、デバイスへのサンプルが入ったボトルを接続しますその上GL45安全キャップを提供します。
3. 「溶離液」リザーバ内に溶離液の200μlのをロードします。
4. 「希釈」リザーバ内の負荷ジ水800μLを。
5. 抽出工程中に処理水を収集するために、廃棄物の出口にボトルを置きます。フォーマットは重要ではないが、体積が試料体積に関して十分に大きくする必要があります。
6. 1.5ミリリットルの最小容積容量を有するセンサー出口に小さなバイアルを置きます。濃縮された溶出液および希釈液を収集する際に気泡がこの出口で形成するように1ミリリットルの最大容量は小さくなりすぎます。
7. 逆時計回りのさらなる移動が不可能になるまで、圧力調整器は、それを手動で回して閉じた位置にあることを確認します。

プロトタイプ4. SPE

1. 背面のボタンを押して、プロトタイプのスイッチをオンにします。
2. ユーザーインターフェースを用意し、プログラムを選択します
   1. ユーザーインターフェースを開きます。選択デバイスがリストから接続し、ボタン「次へ」をクリックされているコンピュータの通信ポート。
   2. 値PSET 580とdpsetのための30を入力します。ポンプが動作しているとき、580±30ミリバールで加圧されたシステムや貯水池内の圧力を維持するために調整されます。
   3. 自動モードを選択します。
   4. 自動モードのコーナーでは、ボックス「設定ファイルパス」内のプログラムファイルをロードします。
3. 圧力調整器を調整します
   1. ポンプを起動します。
   2. プリプレグのための読み値は劣るが、320ミリバールに近くなるまで手動で圧力調整器を回します。
   3. ポンプを停止します。
4. SPE手順を開始します
   1. 自動モードの隅に押して「スタート」。ポンプはスイッチオンし、抽出、溶出および希釈のステップが自動的にお互いに従います。 100 mlのサンプルの全体の手順は、50分で行われます。
   2. プリプレグの値を確認してください。最適な流量を確保するために、抽出工程中に350ミリバール - それは範囲320でなければなりません。
   3. 分析まで暗所に4〜5℃の小瓶と店を閉じます。分析対象物の劣化を防止するために、次の30時間で分析を実行します。
   4. 処理された水を廃棄してください。
5. システムのクリーニング
   注：各抽出手順の後、システムは、交差汚染を防止するために洗浄される必要があります。
   1. GL 45ガラス瓶中のメタノール70％v / vの10 mlの溶液を調製します。
   2. SPEカラムを抜いて、コネクタ付きチューブを差し込みます。
   3. 自動モードでは、「クリーニング」ファイルを選択し、同じ圧力設定で起動します。

ELISAとエストラジオール濃度の5検出

1. 使用されているELISAキットで提供されたプロトコルに示されているように濃度のキャリブレーションサンプルを準備します。 1 Calibraでの準備ンは、サンプルと同じマトリックスを設定し、メタノール10％v / vので設定1つの較正。
2. 製造業者の指示に従って、プレート上のウェル中の試料の必要量を分注します。 、キャリブレーションサンプルを使用して変更されていないし、メタノール10％v / vの水のフィルタリングではなく、SPEで処理したサンプル、および濃縮されたサンプルをスパイクしました。検定に関連する誤差を低減するために、サンプルあたり3ウェルを使用してください。
3. 酵素と反応物の添加のためのキット、インキュベーション時間、洗浄、さらに反応が設けられており、プロトコルの指示に従ってください。
4. プレートリーダー機器との​​キット製造業者の説明書に従って、各ウェルに光信号を読み取り、データを収集します。
5. 較正曲線に適合し、同じマトリックスと最初のサンプル中、およびメタノール10％v / vのに富む試料中のE2濃度を決定するために、プレートリーダー装置のソフトウェアを使用します。

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結果

吸着剤の充填の再現性は、乾燥することによって評価し、ガラスバイアルにピペッティング吸着剤を重み付けし、その結果を図1に示された。 図2に示すように、注入の時間の再現性を、100 mlのサンプルを試験した。初期およびプレで濃縮スパイクされたサンプルは、17βエストラジオールのための市販のELISAキットを用いて測定し?...

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ディスカッション

イムノアッセイを用いて分析を行った水試料の調製のための新しい方法を提案しました。機器は、自動化されたユーザーフレンドリーな方法で固相抽出を行うことができます。

システムに前の注入に水試料の濾過が非常に重要です。溶液中にまだ存在する任意の粒子は、潜在的に流体ネットワークの目詰まりの原因とSPEカラムを妨害します。もう一つの重要なステップ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L