効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

要約

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

要約

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

概要

原子レベルでタンパク質の構造を理解することは、生物学的経路および疾患の分子基盤を解明する鍵となります。 X線タンパク質結晶学は、高分子構造を決定するための最も広く使用される/適用可能な方法です。この方法の主な課題は、適切に折り畳まれた、純粋なタンパク質の十分な量を得ることです。これは、特に、特定の翻訳後修飾を受ける哺乳類分泌タンパク質を扱う問題となります。

細菌発現タンパク質は、タンパク質データバンク¹に堆積し結晶化するタンパク質の主要な源です。それらは安価、高速であり、典型的にはタンパク質の高収量を産生するための細菌発現系は、主に好ましいです。しかし、細菌中で発現哺乳動物タンパク質の細胞外ドメインは、多くの場合、適切にケースがリフォールディングし、大規模な精製工程をfoを均一に得るために必要とされる、折り畳まれていませんldedタンパク質。さらに、多くの哺乳動物タンパク質は、適切なフォールディング^{2を達成するために} 、翻訳後グリコシル化を必要とします。酵母または昆虫細胞での発現およびグリコシル化は、フォールディングの問題を克服することができるが、グリコシル化を含む翻訳後修飾は、不正確なまたは不均一な修飾を有するタンパク質をもたらす、哺乳動物細胞³のものとは大きく異なります。

哺乳動物細胞は、適切な翻訳後修飾や折りたたみを確保するために必要なすべての分子機構を表現します。しかしながら、これらの発現系は、典型的には、限られた収率及び試薬および消耗品のコスト高のために、ほとんどの研究室で好ましくない。ポリエチレンイミン（PEI）は、標準的なトランスフェクション試薬は、比較的安価であるが、細胞培地、DNA、及び培養装置におけるコストの増加をもたらす、かなりの細胞毒性および低いトランスフェクション効率を課します。 PEIへの多くの選択肢が非常に高価です。我々は対処します改善された細胞培養ツールの組み合わせを記述し、化学的に単一工程精製し、分泌された哺乳動物タンパク質の発現のための迅速で比較的安価な方法に対するPEI修飾することによって、これらの問題。この強力な方法は、機能的および生化学的研究⁴のために十分な収率を与え、場合によっては、さらに精製せずに結晶化を受けやすいタンパク質をもたらします。

このプロトコルは、懸濁液中で増殖させたヒト胚腎臓（HEK）293F細胞における分泌哺乳動物タンパク質のための発現と歩留まりを最大化するために、いくつかの手法について説明します。トランスフェクション効率（及び費用）、タンパク質産生および精製は、すべて非常にこのプロトコルに従うことによって強化されます。シングルステップ開環反応（文献⁵に詳細に記載さPEI-TMC-25、合成および特性）を介してカルバメートの付加により修飾PEIが大きく、カチオン性の細胞毒性を減少させ、トランスフェクション効率を向上させます膜破壊し、それに応じて、実験のコストを削減します。さらに、細胞生存率およびタンパク質の発現が大幅にグルコースおよびビタミンを供給するための培養栄養補助食品の添加によって改善されます。重要なことには、グリコシル化タンパク質の産生、キフネンシンによる治療、マンノシダーゼIの非毒性の化学阻害剤のための代わりに単一のN-アセチルグルコサミンを有するタンパク質を生成するためにエンドグリコシダーゼEndoHfによって除去することができる定義された、未成熟グリカンを有するタンパク質を生成します完全長のN-結合グリカン^6。最後に、無血清、化学的に定義された培地中へのタンパク質の分泌は、構造的および生化学的研究のための迅速かつ容易な精製を可能にします。シングルステップニッケル - ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）樹脂精製上清中の種の汚染の大部分を除去し、ある場合には、結晶化のために十分な純度のタンパク質を得ることができます。

プロトコル

大規模な一過性トランスフェクションのためのプラスミドDNAのミリグラム量の1生産

1. 制限部位は、クローニング、またはその他の適切な技術を用いて、高コピー数の哺乳動物発現ベクターに目的のタンパク質をクローニングします。
   1. 最適な結果を得るために、組み込まれているC末端の6Hisタグ、強力なプロモーターKozak配列および最適化された分泌シグナルpHLsec ⁷ベクトルを、使用しています。
2. コンピテント細胞にプラスミドを変換します。
   1. プラスミドDNA1μgのにコンピテント大腸菌細胞の20μlを添加し、氷上で30分間インキュベートします。
   2. 35秒間42℃で熱ショック細胞は、その後2分間氷上でインキュベートします。
   3. 微生物の増殖培地（SOC）の300μlを添加して、220rpmで振とうしながら、45分間37℃でインキュベートします。
   4. 適切な抗生物質選択と寒天プレート上で平板細胞。
      1. プラスミドはpHLsecベクターである場合は、100μg/ mlのカルベニシリンを使用してください。
3. ルリアブロス（LB）メディアの250ミリリットル中の培養コロニーは、220 rpmで振とうしながら、37℃で100μg/ mlの抗生物質（カルベニシリン）、O / Nで補充。
4. 製造業者のプロトコルに従ってハイスピー​​ドプラスミドマキシキットを使用して培養物からDNAを精製します。
   1. 代わりにバッファTEの、バッファEB（10mMのトリス-Cl、pH8.5）中のDNAを溶出します。
   2. -20℃でのトランスフェクションおよびストアに必要な量で精製されたプラスミドを等分。

293F細胞の2大規模培養および一過性トランスフェクション

1. グルタミン10ml及び5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（両方とも100倍）を用いて追補1 L 293F媒体。 4℃で保存します。 5 mlのペニシリン/ストレプトマイシンを無血清条件で十分な強度であり、減少した抗生物質の濃度は、タンパク質収率を改善するトランスフェクション時に細胞生存率を改善します。
2. 1Lのポリカーボネート中の300ミリリットル培地で培養293F細胞は、通気キャップで三角フラスコバッフル8％CO _2、37℃での、標準的な組織培養インキュベーター中で振盪しながら。
3. 5×10 ⁵ / mlの密度、トランスフェクションの前日に細胞を希釈します。
4. 293F培地における細胞ブーストw / vの2％の10％の容量を追加することにより、トランスフェクション、補充培地の日。
   1. 500ミリグラム/ dLのグルコース濃度を達成するために必要に応じて、製造者の指示及び使用サプリメントによるグルコースモニタを使用してグルコース濃度を測定します。
5. タンパク質のグリコシル化を制御するには、この段階でキフネンシン（1 / mlの最終濃度）を追加します。
6. 1×10 ⁶個の細胞あたり1μgのプラスミドに必要なDNAの量を計算します。無菌条件下で、5 mlの無血清培地中でDNAを希釈します。
7. トランスフェクション試薬μlの2当たり1μgのプラスミドに必要なトランスフェクション試薬の量を計算します。無菌条件下で、5 mlの無血清培地中でトランスフェクション試薬（PEI-TMC-25）を希釈します。
8. 追加1ミリリットル単位でDNA溶液へのトランスフェクション試薬は、穏やかに混合します。形成するための試薬-DNA複合体を室温で30分間インキュベートします。その後、滴下方式で細胞上に溶液を加えます。
9. トランスフェクションされた細胞は、72〜96時間タンパク質を発現することを許可します。 〜10％の容量セルブースト毎日メディア、または必要に応じてとの補足は、グルコースが400〜600ミリグラム/デシリットルを読み続けます。

3.精製

1. 細胞をペレット化した後、上清を収集するために1300×gで20分間、遠心分離フラスコに培養物を遠心分離しデカントします。必要な場合は、2番目の時間をスピンおよび/または上清を明確にするために、0.22μmのフィルターを使用しています。
2. 10％容積の10倍のNi-NTA結合バッファー追加（1.5 MのNaCl、0.5 _K 2 HPO _4、0.1 MトリスpHは8.5、50mMのイミダゾール）。
3. カラム内のNi-NTAスラリーを2mlを添加し、1×結合緩衝液の10カラム容量（CV）で平衡化することによって、重力カラムを準備します。可能な場合は、4℃の部屋にすべての列の手順を実行します。 Alternativエリー、チルタンパク質とカラム工程の前に、氷の上のすべてのバッファ、および蛋白質を維持し、収集したフロースルー氷上。
   注：のNi-NTAスラリーは、50体積％の樹脂であり、製造者述べ結合能力は、50 mg / mlです。 Ni-NTAビーズを複数の用途のために再充電することができます
4. 樹脂上で上清をフローとフロースルーを収集します。この手順を繰り返します。
5. 洗浄緩衝液（300mMのNaCl、50mMの_K 2 HPO _4、20mMのイミダゾールをpH8）の10 CVで洗浄しました。
6. 溶出緩衝液（300mMのNaCl、50mMの_K 2 HPO _4、250 mMイミダゾールのpHは8）の5 CVでタンパク質を溶出します。
7. 脱グリコシル化が必要な場合：
   1. 0.5ミリリットルの最終容量のために、遠心濃縮器を用いて、0.43ミリリットルに溶出液を濃縮します。沈殿物を形成する場合は、16,000×gで4℃で遠心分離することにより、任意の破片をペレット化。
   2. 500 mMのクエン酸ナトリウムのpHが5.5の50μLを加えます。
   3. EndoHf20μlの（1×10 ⁶ U / ml）を追加します。室温で2時間インキュベートします。
      ありませんE：酵素が濃縮されたタンパク質が凝集するおそれがある、37℃で最適に動作します。脱グリコシル化は、SDS-PAGEまたはイムノブロットによって評価すると、RTインキュベーションを拡張し、不完全です。酵素は4℃で活性を有していません。
   4. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または最終貯蔵緩衝液で洗浄アミロース樹​​脂3倍：EndoHfを削除します。 4°Cで1時間樹脂を有するタンパク質をインキュベートします。ビーズをペレット化し、上清を回収し千×gで5分間回転さ。
   5. 適切な分子量カットオフ遠心フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、保存緩衝液（150mMのNaCl及び20mMのHEPES pH7.5）中に緩衝液交換。

結果

ここで骨髄細胞2（hTREM2、残基19から132）上に発現ヒトタンパ​​ク質誘発性受容体から分泌される13 kDaの免疫グロブリン（IG）ドメインに適用され、この発現系の結果に従います。 TREM2は2つのジスルフィド結合と2つのN結合型グリコシル化部位を有する単一の細胞外Igドメインを含むI型膜貫通タンパク質です。多くの他のIgドメインタンパク質⁸とは異なり、TREM2は、細菌封入体⁹

ディスカッション

HEK 293F細胞は、翻訳後修飾を必要とするタンパク質の強固な生産を提供しています。このシステムは、それ以外の場合は、より日常的表現のツールを使用して存在しないことになるジスルフィド、グリコシル化、およびリン酸化を含むネイティブに折りたたまれたタンパク質の迅速かつスケーラブルな発現を可能にします。また、このシステムは、単に複数のプラスミドの同時トランスフェ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919