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要約

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

要約

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

概要

心臓組織工学は、より最近になって、両方のマウス心筋1-6と、から作られた完全に機能する、鼓動組織、ヒト幹細胞由来の心筋細胞7-12の結果を公表する複数のグループで、10年間で大きく前進しました。心臓組織工学の分野は、二つの主要な本質的に独立した目標によって駆動される：1）機能4-6を改善することができない心臓に移植することができる外因性の移植片を開発します。及び2）生理学および疾患を研究するためのin vitroモデルの開発、または治療開発の2,7のためのスクリーニングツールとしてします。

三次元（3-D）細胞培養物を、3-Dマトリックスは、従来の2次元単層細胞培養物よりも自然な心臓の微小環境を反映するように、次世代のスクリーニングツールを開発するために必須であると考えられます。実際に細胞生物学のいくつかの側面は、2次元対3次元培養13,14根本的に異なっています。細胞外マトリックス、および細胞集団：さらに、操作心臓組織は完全に定義された成分から構成されています。細胞外マトリックス組成物（通常のフィブリン9またはコラーゲン7,8,10）を厳密に制御しつつ、従来の操作されたヒト心臓組織のために、入力細胞組成物は、あまりの指向心臓分化の細胞の混合物全体で、定義されますか胚性幹細胞（ESC 7,9）や人工多能性幹細胞（IPSC 10,12）を組織に添加されます。特定の細胞株および使用する分化プロトコルの効率に応じて、心筋の得率（ すなわち 、ventricular-、atrial-、またはペースメーカーのような）、25％未満から90％以上に、特定の心筋細胞表現型の範囲とすることができますまたしても、非心筋細胞画分は15,16非常に不均一であることで差別心臓メートルの成熟度を変更することができ、変化させることができます17を yocytes。

最近の心臓組織工学作業は心臓レポーターヒト胚性幹細胞株8または細胞表面マーカー18は、分化の心筋細胞成分を単離するために使用されるのいずれかで、細胞のインプット集団を制御しようとしています。唯一の心筋細胞で構成最初に組織が理想的であるように思われるが、これは実際にはそうではありません。心筋細胞の1：1の比率：線維芽細胞が最も高い単収縮力8を生成するのみ心筋細胞で構成hECTsは、いくつかのグループは、3を見つけることで、機能的な組織へと圧縮することができません。生細胞の選別のための表面マーカーを含む、様々な細胞の選択方法を用いることにより、定義された細胞集団でhECTsを作成することが可能です。非心臓マーカー間質細胞は、推定上の線維芽細胞マーカーCD90 19,20のように、しばらくの間利用可能であったが、心筋細胞の表面マーカーは、より困難でした特定する。 SIRPαは、人間の心筋細胞18のために同定された最初の心臓表面マーカー間にあったと心臓系統に高度に選択的であることが示されています。最近、我々は、SIRPα+およびCD90のための二重ソートことを発見した-細胞、線維芽細胞様の表現型（Josowitz、未発表の観察）を示すCD90 +集団と、ほぼ純粋な心筋細胞が得られます。心筋細胞およびCD90 +線維芽細胞- SIRPα+ / CD90の1組み合わせ：これらの収集した知見に基づき、本明細書中で我々は3を使用してhECTsを作成する方法を説明します。

完全に定義された人間の心臓組織を設計する能力は、堅牢なスクリーニングツールを作成するためだけでなく、新興の細胞および遺伝子に基づく心臓治療を研究するためのモデルシステムを開発するだけでなく、必要不可欠です。間葉系幹細胞（MSC）を含む細胞タイプを利用心不全、特に、多数の細胞療法、21 、心臓幹細胞22及び骨髄単核細胞を23~25は 、臨床試験で試験されています。最初の結果の多くは21,23,25を約 ​​束してきたが、最初の利点は、多くの場合、時間26-29とともに減少します。同様の傾向が原因MSC補充に重要な機能的利益を表示するマウス操作心臓組織において報告されているが、利点は、長期培養1中持続しません。サブ最適な性能を根底にある細胞治療を支配するメカニズムの限られた知識です。どのように治療用細胞それらの有益な影響だけでなく、筋細胞nonmyocyte相互作用の潜在的な負の影響を及ぼし、心不全の患者のために、最小限の副作用で、臨床的に有意かつ持続的な利益をもたらす改善された治療法の開発を可能にする。より深く理解

ここでは、interrogに定義されたhECTsの使用を記載しています細胞ベースの治療のメカニズムを食べました。制御された組織組成物は、心筋細胞の性能に影響を与える特定の因子を同定することが不可欠です。我々はラットECTS 1で実証したように、直接目的の治療用細胞型（ 例えば 、MSCS）でhECTsを補完する、心筋細胞のパフォーマンスへの影響を明らかにすることができます。

次の多段階プロトコルは、マルチ組織バイオリアクターの製造に続いて、組織構造および機能分析の説明を結論、指向心臓幹細胞の分化から始まります。我々の実験は、NIH-承認H7ヒト胚性幹細胞（hESCの）ラインを使用して実行されます。しかし、次のプロトコルは、追加のhESCラインと同様の結果で三誘導多能性幹細胞（hiPSC）株を用いて試験されました。我々は、HECT製造における心筋細胞分化および成功効率は、特にfoは、細胞株に依存することができることを見出しました個々の患者由来のR hiPSCライン。このプロトコルに従うことにより、2個の6ウェルディッシュは、20日間分化さと十分な6定義された組織を作るために、ソートした後、約250万筋細胞を生み出す168万のhESC（ウェル当たり14万細胞）、の合計でメッキされています。

プロトコル

注：HEPAろ過クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌状態のすべてのセルの操作を実行し、0.2μmのフィルターを介してそれらをフィルタリングすることにより、すべてのソリューションを殺菌。同じ無菌状態または層流フードのいずれかで組織の構築と機能のテストを実行します。

心臓分化のための準備でH7のhESCの1播種

  1. （1日目）基底膜マトリックスの準備
    1. 4℃で一晩氷上でのhESC資格の基底膜マトリックスの150μlのアリコートを解凍します。
  2. コー​​ティングしたプレート上のhESCの（日0-4）めっき
    1. 氷冷DMEM / F12の12ミリリットルに解凍したマトリックスを希釈し、よく混ぜます。
    2. 転送6ウェルの組織培養処理皿の各ウェルにDMEM / F12マトリックス溶液1ml。マトリックス缶コート2つの6ウェルプレートの各アリコート。
    3. 少なくとも1時間室温でコーティングしたプレートをインキュベートします。
      注：で我々の経験では、パラフィンで密封被覆された皿は、使用前に最大10日間、4℃でマトリックス溶液中に保存することができます。
    4. 約75％のコンフルエンスで、非酵素的解離試薬の6ミリリットルを使用して、10cmディッシュからH7ヒトES細胞を解離します。 5分後、穏やかに使い捨てセルスクレイパーを用いて培養表面から細胞を掻き取り、滅菌15mL遠心管に細胞懸濁液を移します。
    5. 幹細胞株の増殖のために（さらにヒトES細胞を解離する解離試薬の5.5ミリリットルを残して）15mlチューブから細胞を用いた解離溶液の0.5ミリリットルを取り外し、新しい滅菌15mlチューブに移します。
    6. 20℃で5分間、300×gで細胞を0.5mlのペレット。上清を除去し、穏やかに、新しい、コーティングされた、10cmの組織培養皿に移し、幹細胞株を維持するために37℃、5％CO 2を維持する 1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有する多能性幹細胞培地8mlに再懸濁。
      注意：メディアの変更中に氷の上で多能性幹細胞のメディアを保管してください。
    7. 一方、解離溶液の残りの5.5ミリリットルに10mMのROCK阻害剤Y-27632の5.5μlを添加し、別の5〜10分間室温でインキュベートし続けています。静かに5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて細胞を混ぜます。その後、室温で5分間、300×gで細胞をペレット化し、単一細胞懸濁液が得られるまでインキュベートし続けます。
    8. 多能性幹細胞培地5mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
    9. ウェルあたり14万細胞の密度で6ウェルディッシュの各ウェルをシード。 6定義された組織の合計を作成するために、2つの6ウェルプレートに播種します。めっき後、残りの細胞を処分。
    10. 多能性幹細胞培地でよく、1ミリリットル充填し、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 24時間後、培地を除去し、各ウェルに新鮮な多能性幹細胞培地の2ミリリットルを追加します（ 図1A ）。
    11. 毎日のプレートの合流点をチェックして、細胞が約75％コンフルエンス（ 図1B - D）に達すると分化を始めます。

2.（日4-24）心筋細胞30,31へのヒト胚性幹細胞の分化

  1. （日4-7、分化日0-3）中胚葉誘導
    1. 10ミリリットルのB27の（インスリンなし）サプリメントおよびペニシリン-ストレプトマイシン原液（;万/ mlのストレプトマイシン万IU / mlペニシリン）の5ミリリットルと500ミリリットルをRPMI 1640を組み合わせることにより、RPMIの分化培地I（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
    2. （4日目、分化0日）を各ウェルから多能性幹細胞のメディアを取り出してRPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子GSK3阻害剤CHIR99021（10 mMストック、6μM最終濃度）の2.4μLを添加することにより、中胚葉誘導培地を準備しますANDウェル当たり中胚葉誘導培地2mlで交換してください。インキュベーターにプレートを返します。
      注意：重要な細胞死は、典型的には、CHIR99021（ 図1E）の添加で発生します。単層は回復しますが、DMEM / F12リンスと死細胞を洗い流すことが重要です。
    3. 前述したように（5日目、分化1日目）、新鮮な中胚葉誘導培地を準備します。各ウェルから古いメディアを削除し、ウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルで一回すすいでください。各ウェルに新鮮な中胚葉誘導メディアの2ミリリットルを追加します。
      注：デイ0-10から毎日リンスすると、大幅に心筋細胞の収率および純度を向上させます。
    4. （6日目、分化2日目）は、心臓の誘導培地を取り出して、ウェルあたり1ミリリットルDMEM / F12で一回すすいでください。 2ミリリットルのRPMI分化培地でリンスを交換I（ない小分子が、それでもB27（インスリンなし）サプリメントで追加されません）、インキュベーターに戻します。
  2. （日7-13、分化ダY 3-10）心臓中胚葉誘導
    1. （7日目、分化3日目）RPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子Wntシグナル阻害剤のIWR-1（最終10mMストック、5μM）の6μLを追加することによって、心臓中胚葉誘導培地を準備
    2. 各ウェルから培地を除去、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たりの心臓中胚葉誘導培地2mlで交換してください。
    3. 上記のように（8日、分化4日目）の心臓中胚葉誘導培地の追加の12ミリリットルを準備します。メディアを取り出し、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たり新鮮な心臓中胚葉分化培地2mlで交換し、インキュベーターに戻り、前日追加。
    4. （日9-10、分化日5-6）の両方の日には、心臓中胚葉誘導培地を除去し、DMEM / F12の各ウェルを1ミリリットルをすすぎます。
    5. 新鮮なRPMI分化メディアの2ミリリットルを追加I（ない小分子が、それでも、インスリンなしB27（）サプリメントで追加されません）各ウェルにプレートをインキュベーターに戻します。
  3. （日11月24日、分化日7月20日）hES由来心筋細胞組織/成熟
    1. 10mLのB27の（インスリンで）補足およびペニシリン-ストレプトマイシンストック溶液5ml 500mlでをRPMI 1640組み合わせることによってRPMI分化培地II（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
    2. （11日目、分化7日目）を各ウェルから（インスリンなし）RPMI分化培地を除去し、1mlのDMEM / F12で洗い流してください。各ウェルに（インスリンとの）新しいRPMI分化メディアIIの2ミリリットルと交換し、インキュベーターに戻します。
      注：自発拍動は、第7日目と10との間に観察されるべきである叩解この時間の間に観察されていない場合、それは一般的に乏しい分化効率を示しています。プロトコルは鼓動を観察するための努力で15日目まで継続することができますが、何の鼓動は1日15で観察されない場合には、STに最高です芸術の新しい分化。
    3. （日12月24日、分化日8月20日）毎日、古い分化培地を除去し、鼓動している単層（ 図1F、 ビデオ図1の細胞成熟と組織を可能にするために、ウェルあたりの新鮮なRPMIの分化培地IIの2ミリリットルと交換）。
      注：残留細胞死によっては、分化10日目を通してDMEM / F12の1mlでリンスすることが必要であり得ます。

3.（24日目、分化20日目）心筋細胞と線維芽細胞様細胞の単離

  1. 単層からの細胞を解離
    1. 分化培地を取り出して、1mlのPBSで一回すすいでください。
    2. 各ウェルに酵素的解離溶液（0.04％トリプシン/ 0.03％EDTA）の1ミリリットルで単層を解離させます。
    3. 10分間インキュベーターにプレートを移動します。一方、トリプシン中和液の6ミリリットルにROCK阻害剤の12μlを添加します。
    4. GentlYは、トリプシン溶液を中和するために、プレートの各ウェルにROCK阻害剤を含有するトリプシン中和溶液1mlを加えます。
    5. 無菌トランスファーピペットを用いて、穏やかに細胞クラスターを分割するために、各ウェルを混ぜます。
    6. 15mlの遠心管に6ウェルプレートからのすべての12ミリリットルを転送します。
      注：2つの6ウェルプレートは、このプロトコルで使用されているので二つの15 mlチューブが必要となります。
    7. プレートの1つのウェルに移し、PBSの3ミリリットルをし、その後は順次ディッシュ上の任意の残留細胞を収集するために、後続の各ウェルに同じ3ミリリットルを転送します。よく細胞を含む同じ15ミリリットルの遠心分離管に最終から残りの3ミリリットルを転送します。
    8. 4℃で5分間、300×gでペレット。
  2. FACSによりライブセルソーティングのための細胞を調製
    1. ROCK阻害剤50μlの氷上でPBSの45ミリリットルにウシ胎児血清の5ミリリットルを追加することにより、染色バッファーを準備します。
    2. セルペルから上清を除去（3.1.8で）聞かせ染色緩衝液の1.2ミリリットルで再懸濁。
    3. 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに200μlの細胞懸濁液を転送します。これは、負の染色対照になります。
    4. 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに細胞懸濁液の残りの1ミリリットルを転送し、2μlのSIRPα-PE / Cy7の追加（1：500希釈）およびCD90-FITC4μlの（1：250希釈） 。静かに転送ピペットで細胞懸濁液を混合し、氷に戻ります。
    5. 4℃で1時間、氷上で、ロッカーシェーカー上で、ネガティブコントロールおよびサンプルの両方をインキュベートします。
    6. 2 15mlの遠心管に（インスリンと）RPMI培地の3ミリリットルを追加することにより、サンプル採取チューブを準備します。各チューブにROCK阻害剤の3μlを添加し、氷上で保存します。
    7. 4℃で5分間、300×gで染色された細胞をペレット化し、リンス当たりの氷冷PBSの少なくとも10mlで二回リンス。
    8. 染色緩衝液5mlにDAPI（1μg/ ml）の1μLを加えます。優しく転送ピペットを用いて、DAPI含有染色用緩衝液1-3 mlのサンプルペレットを再懸濁します。
    9. （何のDAPIを添加しないで）負の制御に染色緩衝液500μlを追加します。
    10. 静かに細胞の塊を除去し、氷上でFACSチューブをポリスチレン転送するために40μmのセルストレーナーを介して負対照および試料の両方をフィルタリングします。すぐにセルソーターにサンプルをもたらします。
    11. 方法18のソート確立生細胞と同様に、ゲートを設定し、生細胞（DAPI負）を選択し、FITC +（ すなわち 、CD90 +線維芽細胞）とPE / Cy7の+（ すなわち 、SIRPα+心筋細胞の両方を収集するために、負のコントロールを使用）20 PSI（ 図2）で独立した集団。
      注：ゲートを設定した後、ネガティブコントロールは、心臓トロポニンTについての染色によって、分化効率を決定するために、4％PFAで固定することができます。
      注：一部の研究者が使用することを好みますアイソタイプ対照ではなく、非染色対照は、非特異的抗体結合を補償するためにゲートを設定します。いわゆる蛍光マイナス1（FMO）コントロールは、別の可能性です。 FITC、DAPIおよびPE-Cy7の信号の明確な二峰性分布のために、我々は控えめに、おそらくいくつかの真陽性を除外しますが、任意の偽陽性を最小限に抑えることができます正のゲートへと遠くを目指し、陽性集団からゲートさ。
  3. 組織工学のための準備における細胞再凝集
    1. 細胞ソートした後、10％新生児ウシ血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％アンホテリシンB（「NBS培地」）を含有するDMEMを1mlの両方収集チューブ再懸濁ペレット。
    2. 60 cm 2の（10cmの皿）当たり2百万個の細胞の密度でペトリ皿に処理1の比率と非組織培養中で合わせた細胞をプレート：3SIRPα+及びCD90 +細胞を再結合します。 NBSメディアと10の10ミリリットルを追加します。1; ROCK阻害剤Y-27632のリットル。
    3. 小クラスターにセル再凝集を可能にするために、48時間組織培養インキュベーター中で細胞懸濁液を置き。

4.ヒト心臓組織工学

  1. マルチ組織のバイオリアクターを作製
    注： 図3Aのイラストを補うために、詳細なバイオリアクター設計回路図とCADファイルには、著者からのリクエストも承ります。
    1. 機械ポリテトラフルオロエチレンの9×33のx 3.25ミリメートルの直方体に直径0.5mmの6等間隔の穴を掘削することにより、PDMSのマスターモールド。
    2. 25×35×11ミリメートル3を測定ポリスルホンからエンドミル、機械フレームを使用しました。フレームの目的は、ベ​​ースプレートのウェルと整列して（上記の製キャストから構築）PDMSのポストを保持することです。
    3. 1 mmのエンドミルを使用して、マシン6ウェル（6×1×1ミリメートル3）、黒ポリの20×40×5ミリメートル3個に離れて4ミリメートルテトラフルオロエチレンは、ベースプレートを形成します。
    4. / w比wの1と6の力感知ポストの2行を作成するために、カスタムポリテトラフルオロエチレンモールド（ステップ4.1.1）に追加して、一晩の下でインキュベート：10でエラストマーベースとポリジメチルシロキサン（PDMS）のための硬化剤を混ぜます80℃の真空。硬化後、軽くマスターモールドからPDMSを削除して、慎重に強化されたコントラストと自動リアルタイムポスト偏向追跡のための黒の油性マジックで各ポストのトップをマークします。
      注：ポリテトラフルオロエチレンはかなり柔らかく、簡単に破損することができます。従来のシステムと一貫性のあるPDMSポストジオメトリの寿命を保証するために、鋳造PDMSにマスターモールドを洗浄する際は注意してください。 0.5ミリメートルのワイヤは、各使用後にポスト用の穴をきれいにするために使用されるが、穴​​の内側をこすりないように注意してくださいすることができます。
      注：別の脱ガスに室温で数時間真空下でPDMSで、次に周囲圧力で混合物硬化をしてみましょう。これは、硬化プロセス中にPDMSで形成少ない残留気泡をもたらし得ます。
    5. 蒸気オートクレーブ内のすべてのコンポーネントを滅菌します。
      注：PDMSマスターモールド（ステップ4.1.1）およびポリスルホンフレーム（ステップ4.1.2）は、両方の再利用可能です。キャスト（ステップ4.1.4）から作成されたPDMSの記事も、再利用可能なだけで約10の用途のためのものです。必要に応じて、しかし、より多くのPDMSポストは、マスターモールドを使用して作成することができます。
  2. 再凝集心臓細胞を収集
    1. インキュベーターから再凝集細胞を除去し、50mlの遠心分離管に再凝集メディアのすべての10ミリリットルを転送します。
    2. 3mlのPBSでプレートをすすぎ、再凝集のメディアを含む同じ50ml遠心チューブにリンスを移します。
    3. 10cmディッシュに0.04％トリプシン/ 0.03％のEDTAの3ミリリットルを追加し、5分間インキュベーターに戻します。
    4. 5分後、完全な細胞dissociaを確保するために10倍の倍率で反転複合顕微鏡でプレートを検査しますディッシュからる。いくらかの残留クラスターがまだ接続されている場合は、ゆっくり塊を分離するためにプレートを攪拌。クラスタが付着したまま場合は、別の2-3分間インキュベーターに戻します。 10分以上インキュベートしていないか、または有意な細胞死が発生することがあります。
    5. 一旦、全ての細胞が分離され、トリプシン中和液の3ミリリットルを追加します。穏やかに再凝集培地を含有する50mLの遠心管にトリプシン細胞溶液と転送との中和溶液を混合し、PBSで一回リンス。
    6. 5mlのPBSで全体の皿をすすぎ、細胞を含む同じ50ミリリットルチューブに移します。
    7. 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
    8. 上清を除去し、NBSメディアの1ミリリットル中にペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。
    9. 室温で5分間、300×gでペレット化し、上清を除去します。心臓細胞（CD90 +間質細胞とSIRPα+の MYOCytes）は現在、組織構築のための準備ができています。
  3. （オプション）利息の補足細胞を採取
    注：唯一のSIRPα+心筋細胞およびCD90 +の線維芽細胞様細胞を含む定義された組織に加えて、組織の機能に対するそれらの効果を調べるために、関心の追加のセルを追加することが可能です。例えば、ラットMSCは、ラット工学心臓組織1の機能を増強することが示されています。以下のオプションのステップは、定義されたシステムのための補助的な細胞の収集について説明しています。
    1. 0.25％トリプシン/ 0.1％EDTAを用いて、関心の補足細胞型（ 例えば 、間葉系幹細胞）を収集します。
    2. 次いで、目的の細胞型の適切な細胞培養培地5mlに再懸濁し、室温で5分間、300×gで細胞をペレット。例えば、MSCのために、DMEM培養20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBとCを補充使用しますells。
    3. その後、室温で5分間、300×gで再び細胞をペレット化し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
    4. 、上清を除去し、細胞培養培地の1ミリリットル中に再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。
    5. 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
    6. 上清を取り除きます。補足細胞は現在、組織構築のための準備ができています。
      注：補足細胞は組織中の総細胞数の10％の濃度で添加される場合、各組織500,000心臓細胞（両方のCD90 +間質細胞を含むように、次に定義された組織のために、これは、組織あたり50,000補足細胞を必要としますそして、SIRPα+筋細胞）。
  4. 人間のエンジニア心臓組織を作成します。
    注：室温で氷の上のすべてのソリューションおよび細胞を保管してください。以下に記載されているすべてのボリュームは組織単位です。典型的には、約6の組織を2つの6ウェルPLから構築することができます心臓分化ののATE。
    1. 1 M NaOHを1.5μlのでミリリットル3.125ミリグラム/、10×PBSの9.6μlをし、滅菌超純脱イオン水24.9μlに5 mg / mlでコラーゲン株式の60.0μlの希釈します。
      重要なステップ：気泡は、適切な組織の形成を破壊されますように準備中に各溶液への気泡の導入を避けてください。
    2. コラーゲンミックスを作成するために、希釈コラーゲン混合物に10倍MEMと0.2 N HEPES pHが9両方の12.0μlを添加します。コラーゲンミックスに気泡の導入を避けるために15ミリリットルの遠心分離管の側を下に両方のソリューションを追加します。
    3. コラーゲン混合ミリリットル0.9ミリグラム/最終濃度基底膜マトリックスを追加し、最終組織のミックスを作成するために氷上で保存します。コラーゲンの最終濃度は2 mg / mlであるべきです。
    4. 25μlの最終体積あたりに組織ミックスに再凝集細胞の500,000追加（筋細胞+線維芽細胞濃度が2000万/ mlである）と記入無細胞NBSメディアや関心の補足的な細胞型（ 例えば 、hMSCが）の50,000細胞のいずれかを有する組織、さらには細胞懸濁液を形成するために、よく混ぜます。
      注：補足した細胞の数は、異なる用途のために変化するであろう。ここで、10％の補充が使用されます。
    5. 注意して、空気を導入することなく、バイオリアクターベースプレートの6つの各ウエルにピペット細胞懸濁液の25μlを、ウェルに泡。
    6. 支柱の1対が細胞懸濁液を含む各ウェルに入るようにベースプレートの上にフレームを反転その後、反対側の柱の6対を形成、ポリスルホンフレームの両側にPDMS力センサの2つの行を押してください。
      注：ポリスルホンフレームは、PDMSの整列を助けるためのタブが含まれています。
    7. その後、10cmの皿の内側のカバーを外したままの皿を置いて上に10cmのカバーを置き、全体バイオリアクターアセンブリを移動し、60ミリメートル皿に、ダウンベースプレート、バイオリアクターを慎重に置きます組織培養インキュベーターに、ゲルの組織のための2つの時間を待っています。
    8. 2時間後、インキュベーターからバイオリアクターを削除して、ベースプレートをカバーするのに十分な、アセンブリ全体にNBSメディアの14ミリリットルを追加します。インキュベーターに戻り、毎日メディアの半分を変更します。
    9. 四十八時間後に、慎重に、静かに時のフレームから数ミリメートルをベースプレートの各辺を移動させることにより、ベースプレートを削除するメディアを変更し、その後、組織はメディアに、下に向け、バイオリアクターを返します。
    10. 毎日NBS培地の半分を変え続けます。
      注：組織の自発的収縮が早くも5日目として7に測定可能単収縮力を発生させる、早ければ3日間組織構築後に観察することができます。

結果

心筋細胞を得るためには、Bohelerとリアン分化方法を少し変更したバージョンは30,31に使用されます。分化は、細胞増殖の対数期の間に開始することなく、出発集団（約75％が最適である）選別後の細胞の使用可能な数を得るために十分にコンフルエントであることが肝要です。典型的に、H7ヒトES細胞のために、37℃で維持不可欠8培地、5％CO 2インキュベーター中で6ウェル皿の...

ディスカッション

定義された人間工学的心臓組織（HECT）の構築は、人間の心筋細胞機能のより一貫性と信頼性の高いモデルを提供することができます。批判的に、システム内のすべての細胞および細胞外成分が知られており、従って、分化過程に起因する他の未知の細胞型の交絡の影響を除去し、所望のように操作することができます。急速な細胞増殖と高い収率のバランスをとるためには、分化は、理想的...

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

この作品は、BDG、アメリカに香港TRS T13-706 / 11（KDC）、NIH（R01 HL113499）の研究助成協議会、KDCにTJC、NIH / NHLBI PEN契約HHSN268201000045CにNIH（1F30HL118923-01A1）によってサポートされていましたRJ、および香港特別行政区の研究助成評議会（TBRS、T13-706 / 11）に心臓協会（12PRE12060254）追加の資金調達をRLには、NIH DRB 5T32GM008553-18によって、およびシステムと発達におけるNIDCR、学際的訓練に訓練生としてTJCに提供されました生物学と先天異常T32HD075735。また、作者は感謝して技術支援のためのバイオリアクターとMamdouh Eldalyの加工の支援のためにニューヨークのシティカレッジのザーンセンターでアーサーAutzを認識したいです。我々はまた、寛大にヒト間葉系幹細胞を提供するための心臓分化に関するアドバイス博士ケネスBoheler、博士ジョシュアウサギに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with InsulinLife Technologies17505055
B27 without InsulinLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Human Embryonic Stem CellsWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation ReagentStem Cell Technologies7174
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)Stemgent04-0012Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell SortingCompanyCatalog NumberComments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) PromoCellC-41200
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOptional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
Collagen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
Sodium HydroxideSigma-Aldrich221465
MaterialsCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher ScientificNC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom TubeCorning352235With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
Cell Scraper, DisposableBiologix70-2180
PolysulfoneMcMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)McMaster-Carr
EquipmentCompanyCatalog NumberComments
Dissecting MicroscopeOlympusSZ-61Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing SystemAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
High Speed CameraPixelinkPL-B741UOr similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature ControlUsed to maintain media temperature during data acqusition.
Custom MaterialsCompanyCatalog NumberComments
LabView Post-tracking Programavailable upon request from the authors

参考文献

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

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