アピカル切除マウスモデルは、初期の哺乳類の心臓の再生を研究するために

要約

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

要約

心血管疾患は集中的なライフスタイルの変化による全世界を悩ませています。ハートの再生には、負傷や病気に負けた心筋細胞を修復し、復元するための大きな可能性を秘めています。一定の下等脊​​椎動物の強固な心臓再生とは対照的に、大人の哺乳類の心臓は、通常、心臓の再生および修復のための最小限の容量を示しています。しかし、最近の研究では、（P7へP1）1〜7生後日の間、新生児マウスの心臓が心尖切除（ すなわち 、外科的切断および左心室の頂点の曝露）後の重要な再生能力を保持し、知見とかなりの科学的関心を巻き起こしています。この発見を介して1つの主要な論争は、この重要な知見に複製または拡大するための努力で使用される多様な手術に関連した手順に起因する可能性があります。これらの命令は、動的にマウスモデルにおいて、頂端切除するための材料および方法論を提示します。このげっ歯類survivaの顕著なステップL手術は低体温麻酔、開胸、心臓心室尖部の外科的切断、縫合糸およびマウスの回復を伴います。記載されているアプローチは、心血管研究のための頂端切除マウスモデルの適用を拡大することができます。

概要

Prolonged human life span leads to various aging- and lifestyle-related diseases, including heart failure, a leading cause of mortality. However, without replacement of lost or dysfunctional cardiac muscle cells, current therapeutics can only transiently improve cardiac function^{1, 2}. Thus, it is necessary to discover and develop innovative strategies for cardiac regeneration and repair. The adult mammalian heart has limited regenerative potential. Studies from lower vertebrates, such as urodele amphibians and teleost fish, have provided unprecedented insights into the molecular and cellular mechanisms underlying heart regeneration^{3, 4}. Recently, a neonatal mouse model of heart regeneration has emerged that might enable identification and characterization of more evolutionarily conserved pathophysiological events required for human heart regeneration⁵.

Apical resection refers to the surgical removal of left ventricular apex. This procedure is restricted to 1- to 7-day-old (P1 to P7) mice due to its high lethality in older mice⁶. The cardiac regeneration process in neonatal mice after apical resection is expected to be as follows: (I) rapid and effective formation of a hematoma to seal the apex and prevent exsanguination; (II) cardiomyocyte regeneration and restoration of systolic function^{5, 7}. Recent work has stimulated debate on the significance and efficiency of this model^8-11. Thus, it is important to present the apical resection clearly and in detail. To this end, this protocol vividly and specifically describes a video of how I did apical resection based on a previous protocol⁶.

Understanding the molecular mechanisms underlying cardiac regeneration is of importance for treatment of heart disease characterized by loss and/or injured cardiomyocytes, such as heart failure^{1, 2}. Given the current and promising progress of apical resection in the research of cardiac regeneration, this study could promote the use of this technique and its uses in cardiac regeneration research.

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プロトコル

すべてのマウスの実験では、プロトコル番号H0083R3と国立衛生研究所（NIH）での動物管理使用プログラムによって承認されました。 NHLBI IACUCは鎮痛剤なしでプロトコルを承認しました。

新生児マウスの1の低体温麻酔

1. 手術前にオートクレーブにスポンジや手術用機器を滅菌します。すべての外科的材料を準備し、270℃まで240℃に到達するために、事前にホットビーズ滅菌器で15〜20分を切り替えます。
2. 新鮮な寝具、ネスティング材料ときれいなマウスのケージへの看護母からすべてのC57BL / 6仔（年齢P1）を転送します。子犬が手術室に取り込まれると、母親から分離され、母体の共食いの危険性を低減するために費やされた自分の時間を最小限にするために速やかに頂端手術を行います。
3. 氷のベッドの上にスポンジを入れた後、低体温麻酔を達成するために〜3分間スポンジに1子犬を置きます。 APを観察することによって麻酔を確認NEAと無動とリアの足をつまんで。あまりにも少しの時間が子犬の無動や無呼吸をすることはありませんし、麻酔の過剰な期間は生存率^{12を低下させることができる}ので、頻繁に新生児の状態を確認してください。

2.開胸

1. 外科的なベンチトップ型領域に氷床から子犬を転送し、仰臥位でその腕、脚、尾を固定するテープを使用しています。
2. ベタジンを使用して胸を消毒し、ゆっくりと70％アルコールの準備パッドを使用して清掃してください。
3. Vannas春シザーを用いて、胸腔の第肋間領域に沿って横方向の皮膚切開を行い、その後、心臓へのアクセスを容易にするために記載肋間筋を解剖鈍ら。
   注：血液損失は、外科的処理中に最小化されたときに生存率が向上します。

ハート心室アペックスの3外科切断術

1. 手で、優しく体外に出すために、腹部に圧力を適用します心尖​​。明確な可視化のための滅菌綿棒アプリケーターで手術領域の周りに血液を吸収します。偽手術対照新生児の場合は、4（縫合糸とマウスの回復）をステップに進んで。
2. LV室が露出するまで拡大ランプの下や虹彩切除鋏を使用して、静かに左心室（LV）の断片的な切除を行います。 LVの切除部分を最小限にするように注意してください。約15％の切除は、LV室の最適な露出を達成するために必要です。
3. LV室が露出されると、心臓が胸腔に返すことを確認してください。

4.縫合およびマウスの回復

1. 無菌プロリン6-0縫合糸を使用して胸腔を密封するために一緒に肋骨や筋肉を縫合した後、慎重に皮膚接着剤を用いた皮膚切開部位を閉じます。
2. 回復のために〜3分間加熱ランプの下で新生児を温め、その後、70％のアルコールプレップパッドbefoを用いて血液や接着剤の痕跡をきれいにその同腹子に再導入する再。母親から分離かかる時間を最小限に抑えること頂端切除後の仔の生存率を改善するため、10分以内に全体の外科的手順を完了してみてください。
3. 各手術後、完全な殺菌のため約20秒間ホットビーズ滅菌器のビーズと接触した手術器具を配置します。手術器具がそれぞれの外科手術の前に室温まで冷却してください。
4. ごみのすべての子犬のための手術を完了した後、母親の巣に戻す前に、母親の寝具や排泄物との子犬を混ぜます。
   注：一般的に、ICR / CD-1マウスは、C57BL / 6よりも優れ養母であるが、同じであっても遺伝的背景の授乳中の母親の間で、育成本能が異なります。看護母を変更すると、母体の共食いによって死亡率を減少させる看護母にP0仔を削除して、P1で頂端切除を行う必要がある場合。のみ偽手術または頂端Rのいずれかを実行します子犬の1リターのesection、混合偽手術子犬は子犬⁶の手術群の生存率を低下させる可能性があるため。

5.術後の分析

1. ある日手術後、子犬を監視し、偽手術群の間に差がないことを確認し、生存率を測定するために、仔の数を数えます。手術が適切に行われている場合、生存率は、偽手術群の両方に類似しており、60％以上でなければなりません。
2. ハートの分離と固定。
   1. 70％アルコールの準備を使用して胸をきれいその後、頚椎脱臼により死亡の保証とCO2によって断頭し、21日目、手術後経由で1日目および2日目、手術後に子犬を安楽死させます。
   2. 胸の正中線の皮膚や筋肉を切開して、胸を開きます。
   3. 消費税​​胸腔から全体の心と室温で4％パラホルムアルデヒド、O / N 5mlに、各サンプルの心臓全体を固定します。
3. 翌日、70％エタノールにサンプルを転送します。サンプルは、パラフィン包埋の前に一週間まで保存することができます。
4. スライス5ミクロンの厚さのパラフィン切片全体の心室を通って、再生応答^{5,7を調べるために} 、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびマッソントリクローム染色を行う。具体的には、H＆E染色は、筋肉の交換を検討するために使用され、マッソントリクローム染色を使用しています線維性応答^5を検討します。
5. 関心のある領域を選択し、スライドスキャナを使用して手動でサンプル当たり少なくとも三つの焦点を設定します。デフォルトのパラメータで、製造元の指示に従って40倍の倍率で染色スライドをイメージし、分析します。

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結果

仔マウスは1、2、および21日後に根尖切除術を安楽死させ、彼らの心は、H＆Eおよびマッソントリクローム染色のために回収しました。マッソントリクローム染色で青色は心外膜の細胞外マトリックス⁵の堆積を示しています。 図1Aに示すように、成功した頂端切除と、血餅を効果的に、LV一日後、頂端切除を封止するように形成されています。血液凝固および早期の心臓線...

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ディスカッション

Cardiac regeneration shows potential for the treatment and prevention of heart failure^{1, 2}. Animal models are indispensable and play a critical role in understanding how cardiac regeneration occurs^3-6. Many amphibians and fish regenerate heart tissue in response to injury, providing insight into our understanding of human cardiovascular disease^{13, 14}. In terms of evolution, however, the pathophysiology should be more conserved between a mouse model and humans. Heart regeneration in mammal...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-03	Iridectomy scissors
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Iris Forceps, Straight, Serrated	Fine Science Tools	11064-07
Iris Forceps, Curved, Serrated	Fine Science Tools	11065-07
Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm	Fine Science Tools	14105-12
Round Handled Suture Tying Forceps, Straight	Fine Science Tools	18025-12
Round Handled Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Fine Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
Magnifying Lamp	Luxolamp Corp	IM120
Heating lamp	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Prolene sutures	Ethicon	8889H
Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469
Sterile Cotton Tipped Applicators	Dynarex	4305
WEBCOL Alcohol Prep Pad	Covidien	6818	Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol
Curity All Purpose Sponges	Covidien	9024	Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm)
Bench top protector sheet	KIMTECH SCIENCE	7546	18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% Sodium Chloride, 250ml	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-03
Autoclave	TOMY Digital Biology	SX-700	HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER
Slide scanner	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS