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要約

ゲノム標的分子の直接の標的を同定することは、主要な課題です。 DNA結合分子はゲノムを従事する方法を理解するために、我々は、クロマチン（COSMIC）を単離するための小分子の架橋に依存する方法を開発しました。

要約

ゲノムは、最も効果的な化学療法剤のいくつかの標的であるが、これらの薬剤の多くは、用量を制限する毒性および多くの有害な副作用をもたらすDNA配列特異性を欠いています。配列特異的な小分子でゲノムをターゲットに増加し、治療指数、より少ないオフターゲット効果を有する分子を可能にすることができる。N -methylpyrrole / N -methylimidazoleポリアミドは合理的に絶妙な精度で特定のDNA配列を標的とするように設計することができる分子です。そして、最も自然な転写因子とは異なり、ポリアミドは、親和性の損失なしにメチル化及びchromatinized DNAに結合することができます。ポリアミドの配列特異性が広く、同族サイトの識別（CSI）で、伝統的な生化学的および生物物理学的ア ​​プローチを用いてインビトロで研究されているが、細胞内のゲノム標的に結合するポリアミドの研究では、とらえどころのないまま。ここでは、方法、イゾラへの小分子の架橋を報告テクロマチン（COSMIC）が、それは、ゲノム全体のポリアミド結合部位を特定します。 COSMICは、クロマチン免疫沈降（チップ）と同様であるが、2つの重要な点で異なる：（1）光架橋剤は、結合事象ポリアミドの選択的、時間的に制御された取り込みを可能にするために用いられ、（2）ビオチン親和性ハンドルがポリアミドを精製するために使用され非共有結合しているDNAを減少させる半変性条件下-DNA複合体。 COSMICは、ポリアミドおよび他のゲノム標的の化学療法薬のゲノムワイドな結合事象を明らかにするために使用することができる一般的な戦略です。

概要

人体内の各セルを作るための情報は、DNAにコードされています。その情報を選択的に使用することは、細胞の運命を支配します。転写因子（TFS）は、ゲノム中の遺伝子の特定のサブセットを表現するために、特定のDNA配列に結合するタンパク質であり、TFの誤動作を発達障害、癌、および糖尿病を含む、疾患の広い配列の発現に連結されています。1,2私たちは、選択的ゲノムに結合し、遺伝子調節ネットワークを調節することができる分子の開発に興味を持っていました。

ポリアミドは、N個の -methylpyrroleで構成され、Nライバル天然の転写因子。3-6これらの分子は、DNAの副溝内の特定の配列に結合特異性および親和性を有するDNAを標的とすることができる分子を-methylimidazole合理的に設計されています。4,5,7 -11ポリアミドは、両方の抑制に用いられ、特定のグラムの発現を活性化されていますエン。4,12-19また興味深い20-24抗ウイルス及び抗がん12,13,25-30特性を有しています。ポリアミドの1つの魅力的な特徴は、31,32メチル化とヒストンタンパク質9,10,33に巻き付けているDNA配列にアクセスする能力です。

DNA結合分子の総合的な結合特異性を測定するために、私たちの研究室では、同族のサイト識別子（CSI）メソッドを作成しました。34-39ためのin vitro特異性（genomescapes）に基づいて結合部位の予測発生は、ゲノム上に表示することができますin vitroでの結合強度が会合定数に正比例する（K A）。34,35,37これらgenomescapesは、ゲノム全体のポリアミド占有への洞察を提供しますが、生細胞内で結合を測定するポリアミドが課題でした。 DNAはしっかりと結合サイトのアクセシビリティに影響を与える可能性が核にパッケージされています。 Aポリアミドにこれらのchromatinized DNA配列のccessibilityは謎のまま。

最近では、小分子および核酸の間の相互作用を研究する多くの方法が出現している。40-48化学的親和性のキャプチャと超並列DNAシーケンシング（CHEM-SEQ）は、このような技術の一つです。 CHEM-配列は、リガンド-標的相互作用を捕捉するために、関心のゲノム標的と関心の小分子のビオチン化誘導体に小分子を架橋させるために、ホルムアルデヒドを使用しています。48,49

ホルムアルデヒドは、偽陽性を生成することができます間接的な相互作用にリードを架橋する。50私たちはこれらのいわゆる「ファントム」のピークを排除するために光架橋剤とクロマチン（COSMIC）、51を分離するための新しい方法、小分子の架橋を開発した。50開始するには、我々は、設計およびポリアミドの三官能性誘導体が合成されました。これらの分子は、DNA結合POLを含まyamide、光架橋（ソラレン）、および親和性ハンドル（ビオチン、 図1）。三官能性ポリアミドと、我々は共有結合365 nmの紫外線照射、DNAに損傷を与えたり、非ソラレン系架橋を誘導しない波長のポリアミド-DNA相互作用をキャプチャすることができます。51次に、我々はゲノムを断片化し、厳しい、セミ下で撮影DNAを精製非共有結合しているDNAを減少させるための条件を-denaturing。そこで、CHEM-配列に関連する方法として、宇宙観が、DNAのより直接的な読み出しをターゲットに。重要なことには、弱い（K 10 3〜10 4 M -1）DNA用ソラレンの親和性はしない検出衝撃ポリアミド特異。51,52富化DNAフラグメントは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応51のいずれかにより分析することができる（COSMIC、定量PCR）または、次世代シーケンシング53（COSMIC-SEQ）によります。これらのデータは、インターリガンドの公平な、ゲノム誘導設計を可能にそれらの所望のゲノム遺伝子座を持って行動し、オフターゲット効果を最小化します。

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図1.生理活性ポリアミドおよびCOSMIC方式 。 （A）ヘアピンポリアミド1 - 2の標的DNA配列5'-WACGTW-3 '。リニアポリアミド3から4ターゲット5'-AAGAAGAAG-3 '。 N-メチルイミダゾールのリングは、明確にするために太字されています。オープンと黒丸はそれぞれ、N個の -methylpyrrole と N -methylimidazoleを表します。広場は3クロロチオフェンを表し、ダイヤモンドは、βアラニンを表します。ソラレンおよびビオチンは、それぞれ、P及びBで示されています。 （B）COSMIC方式。細胞は、ポリアミドの三官能性誘導体を用いて処理されます。 365 nmのUV照射で架橋した後、細胞を、LでありますysedゲノムDNAを剪断します。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズは、ポリアミド-DNA付加体を捕捉するために添加されます。 DNAが放出され、定量PCR（定量PCR）によって、あるいは、次世代シーケンシング（NGS）によって分析することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

生きた細胞内の1架橋

  1. 〜2.5×10の7 H1細胞、または他の培養細胞で始まります。
    注：H1細胞のこの数は、5〜10 cmのディッシュ（約40％の集密度）に相当します。
  2. 多能性幹細胞をサポートする表面上にコーティングされた皿上E8培地中で細胞を成長させる（材料リストを参照）、および5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃でそれらをインキュベートします。収穫細胞は酵素的に（材料リストを参照してください）​​。注：H1細胞は、90％の密集度を超えないようにしてください。密集度は、H1細胞の自発的な分化を誘導します。 、細胞をカウントし、細胞の余分な10 cmディッシュに成長し、セクション1.8から1.10に記載されているように、酵素的に細胞を持ち上げ、そして血球計数器でそれらをカウントします。
    1. チェンらに記載されているようにE8培養培地を準備します。54
  3. ポリアミドを追加する前に、真空トラップに取り付けたパスツールピペットで過ごし培養培地を除去します。などで新鮮な培地を追加erologicalピペットピペットディスペンサー（10 cmディッシュあたり8ミリリットル）。
    注：細胞を破壊を避けるために、皿の側にメディアを追加します。この時点から以降早期の光架橋を避けるために、光から細胞を保護します。
  4. 直接各皿の培地にピペット（DMSO中、400μMのポリアミド8μlの、400 nMの最終濃度）でポリアミドを追加します。メディアの中に均等にポリアミドを分散させる料理を渦巻。
    注：濃度が変化しますが、何の細胞毒性は、選択された治療のために観察されないことを保証することができます。
  5. 5％CO 2の加湿雰囲気中で細胞を24時間37℃でインキュベートし、そしてそれらは、光から保護されていることを確認。
    注：インキュベーション時間は、時間を横切って結合ポリアミドを測定するように変化させることができます。
  6. 血清学的ピペットとピペットDISを用いて、4 mlのPBS（1.05ミリモルのリン酸二水素カリウム、155.17 mM塩化ナトリウム、2.97 mMリン酸ナトリウム二塩基性）で各10 cmディッシュを洗いますpenser。吸引しPBSおよび3ミリリットルE8培養培地を追加します。
  7. ライトが淡色表示して、5培養皿の蓋を外し、フードの外に平らな面に細胞を配置します。 λ<300 nmの光をフィルタするために5培養皿の上にガラスフィルターを置きます。フィルターの上にUV光源を配置します。架橋試料を365 nmのUV照射（2.4ミリワット/ cm 2）を用いて30分。
    注：架橋時間は、経験的に決定されるべきです。
  8. フードに培養皿をバック転送します。真空トラップに付着したパスツールピペットでメディアを吸引除去します。 4ミリリットルPBSで各10 cmディッシュを洗ってください。 PBSを吸引除去します。細胞を解離させるために10 cmディッシュあたりの細胞解離のための3ミリリットルの酵素を（材料リストを参照）を追加します。 37℃で5分間インキュベートします。
    注： しない酵素を事前に温めます。
  9. 皿当たり3ミリリットルE8メディア​​に酵素をクエンチ。転送は1 15mlのコニカルチューブに細胞を解離しました。
    注：この時点から、氷の上に置いてセル以降。
  10. CentriFUGEを4℃で細胞を5分間、500×gで解離しました。酵素とメディアを除去するために上清を吸引。
    注： 一時停止ポイント 。細胞は、後で後続の処理のために-80℃で保存し、液体窒素中で急速冷凍することができます。

クロマチンの2の単離

  1. 1.2ミリリットルCOSMICバッファを追加します（20 mMトリス - 塩酸[pHが8.1]、2mMのEDTA、150mMのNaCl、1％のTriton-X100、0.1％SDS）と上下ピペットを数回には、各サンプル中のため、細胞ペレットを再懸濁します1.2ミリリットルCOSMICバッファ。
    1. PMSFおよびベンズアミジンおよびペプスタチン1.5μMため、1mMの最終濃度に新鮮な 133μlの100 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）のそれぞれ、100 mMのベンズアミジン、およびプロテアーゼ阻害剤ペプスタチン、150μMを追加します。 2アンバー1.7ミリリットルのマイクロチューブに細胞溶解物の分割ソリューション。
  2. ソニケーター35分（上の10秒、10秒オフ、60％のパワー）と超音波処理は、100の間にゲノムを断片化しますND 500 bpの。
    1. タンク内の水のレベルにマイクロ遠心チューブに平行なクロマチンの溶液のレベルを保持します。目視検査によって、このレベルを確認してください。
      注：DNAを1.5％アガロースゲルで剪断したことを確認してください55
    2. 経験的に超音波処理時間を最適化します。サンプルを冷却するためにリザーバ内に氷の最小量を使用し、氷がサンプルとカップホーンとの間で干渉していないことを確認します。
  3. 遠心サンプル12,000×gで10分。ピペットを用いて新たな琥珀色のマイクロ遠心チューブに移すことによって、水溶性のクロマチンを含有する水溶液を保存します。ペレットを廃棄します。
  4. 新しいマイクロチューブにサンプルの110μlの（10％）を転送し、それを入力するDNAを標識します。 -80℃で保存してください。ステップ3.3で使用するために氷の上クロマチンサンプルの残りの部分を保存します。

リガンド-DNA架橋の3キャプチャ

  1. 60μLを分注するピペットを使用しstreptavi喧騒コーティングされたマイクロチューブ内の磁気ビーズが。 1ミリリットルにCOSMICバッファを追加し、室温で旋回装置5分に混ぜます。ビーズを捕捉するために2分をラック磁気分離に磁気ビーズを置きます。ピペットを用いてCOSMICバッファを削除します。
    注：ビーズを乾燥させないでください。次のステップにすぐ進みます。
  2. ビーズへのクロマチンサンプル（〜1ミリリットル）（60μl）を加え、ビーズを再懸濁します。 4℃で回転させ、ロッキングミキサー上のストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ、少なくとも4時間でクロマチンをインキュベートします。必要に応じて、サンプルのO / Nインキュベートします。

アフィニティー精製したDNAの単離4

  1. 非特異的相互作用を削除するには、次の洗浄バッファーで室温で7分間隔でビーズを洗浄します。各洗浄後にビーズを捕捉するために磁気分離ラックを使用してください。洗浄用緩衝液の各変化の後にビーズを再懸濁します。
  2. 使用前に蒸留脱イオン水とフィルター（0.2ミクロン）で洗浄バッファーを準備します。秒4℃で保存の洗浄緩衝液1と2everalヶ月。毎日洗浄バッファー3新鮮な準備をします。ピペットでサンプルから洗浄バッファーを追加し、削除します。 図 2及び図4は、洗浄液中に、それぞれ、1および3（5ミリモル）を加えます。サンプルは、さらに以下に記載の洗浄前にCOSMICバッファ（一回12時間、一回4時間）で2回洗浄することができます。
    1. 洗浄バッファー1（10mMのトリス-Cl [pHが8.0]、1mMのEDTA、3％SDS）で1回洗浄します。洗浄バッファー2（10mMのトリス-Cl [pH8.0の]、250mMのLiClを、1mMのEDTA、0.5％NP40、1％デオキシコール酸ナトリウム）で1回洗浄します。洗浄緩衝液で3回洗浄する（4 M尿素、10 mMのトリス-Cl [pH7.5の]、1mMのEDTA、0.1％NP-40）。トリスEDTA（TE）緩衝液（10mMトリス-Cl [pHが8.0]、1mMのEDTA）で2回洗浄します。
  3. ピペットで200μlのTEバッファーにビーズを再懸濁します。捕捉されたDNAのこのサンプルは、アフィニティー精製（AP）DNAと呼ばれます。
  4. 10倍の架橋反転バッファ（100mMのトリス-Cl [pHが8.0]と入力し、AP DNAを補足、1 M KOH、4 mMの最終濃度が1Xに90℃で30分間インキュベート56,57のEDTA）。
    注：254 nmのUV照射はソラレン架橋を逆にも使用することができ、58が、シクロブチルピリミジン二量体は、この波長での照射で形成され、DNAの下流の処理を妨害することができます。
  5. AP DNAは、マイクロチューブを室温で2分間ラック磁気分離のサンプルを含有し、ピペットで液体（DNA）を単離することを配置します。新しいアンバーマイクロ遠心チューブに（ビーズから解放されている）AP DNAを転送します。
    注：目的のAP DNAは液体で、もはやビーズに付着されます。
  6. ピペットを用いて100μlのサンプルあたり約1μlの6NのHClを加えてpHを7に濃塩酸で入力し、AP DNAを中和してください。確認したサンプルをピペットでpH紙の上に〜0.5μLを加えて中和されている警告：濃HClを強い腐食性の酸です。あなたの機関によるとハンドル217;適切な個人保護具を使用するためのガイドライン。
  7. 入力とAP DNAの両方に最終濃度μlの0.2μgの/へのRNase A（100 mg / mlの）を追加します。 37℃で1時間インキュベートします。入力とAPのDNAの両方に最終濃度μlの0.2μgの/にプロテイナーゼK（20 mg / mlの）を追加し、追加します。 55℃で1時間インキュベートします。
  8. DNA列のクリーンアップキット（材料リストを参照してください）でDNAを精製する。58μlのDNAグレードのH 2 O中の55溶出DNA -20または-80°Cで保存入力し、APサンプル
  9. 遺伝子座特異的プライマーを用いて、および/または次世代シークエンシングによって、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって、APのDNAを分析します。 95℃10分の1サイクルと、95℃20秒を40サイクル、54℃、56℃20秒、72℃40秒：定量PCRのために、次のパラメータを使用して遺伝子座あたり2μlのAP DNAを使用しています。
    注：アニーリング温度は、使用されるプライマー対の融解温度に応じて変更されるべきです。アニーリングtemperatuを選択その再なし非特異的な増幅と定量サイクルを最小限に抑えることができます。
    注：次世代シーケンシングによる分析のために、読み込みマッピングされた少なくとも10万ドルを目指しています。マッピングされた数は、AP DNAの量を増加させることによって、および配列決定の実行中に、より少ないサンプルを組み合わせることによって増加させることができる読み取ります。詳細は、感度を向上させる読み込みます。 ChIP-seqの分析のための標準パッケージ（例えば、ホーマー、59 MACS、60とSPP 61）は 、COSMIC-seqのデータを扱います。ゲノム配列決定のChIP-seqのとを含む、次世代シーケンシングに頼る他の方法と同様に、反復領域は、アライメントとアセンブリ内の曖昧さを作成するため、技術的な課題のままです。

結果

不均一なゲノム断片化と他の変数を説明するために、精製されたDNAは常にインプットDNAの基準に対して正規化する必要があります。関心対象の遺伝子座に特異的なプライマーを使用することができます。また、陰性対照として、分子が結合すると予想されていない遺伝子座を分析するために有用です。我々は、365 nmの光（ 図2）の照射によりポリアミド占有で> 100倍の増加を参?...

ディスカッション

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

開示事項

A.Z.A. is the sole proprietor of Vista Motif, LLC and WINStep Forward.

謝辞

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)any source
Benzamidineany source
Pepstatinany source
Proteinase Kany source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep KitIlluminaIP-202-1012This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Biosciences356231Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paperany source
amber microcentrifuge tubesany source
microcentrifuge tubesany source
pyrex filterany sourcePyrex baking dishes are suitable
qPCR master mixany source
RNaseany source
HCl (6 N)any source
10-cm tissue culture dishesany source
Serological pipettesany source
Pasteur pipettesany source
Pipette tipsany source
15-ml conical tubesany source
centrifugeany source
microcentrifugeany source
nutatorany source
Magnetic separation rackany source
UV sourceCalSunB001BH0A1AOther UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix SonicatorQsonicaS4000 with 431C1 cup hornOther sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubatorany source
Biological safety cabinet with vacuum outletany source

参考文献

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