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要約

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

要約

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

概要

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

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プロトコル

記載されている全ての研究プロトコルは、シカゴ施設内倫理委員会の大学（IRB）によって検討されています。インフォームドコンセントは、手術前に各患者から得られたものであり、この研究は、シカゴ大学IRBによって承認されました。生物学的安全キャビネットタイプ2との手袋は、保護のためにヒト組織を取り扱う際に使用されるべきであり、細胞の汚染のリスクを低減します。

一次形質転換されていない間質細胞の単離および培養1。

  1. ヒト組織収集と準備。
    1. 腹部手術の間に除去さヒト大網、2 cm 3での標本を取得し、直ちにRTリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（ 図2A）の組織を浸します。 X 2センチメートル大網3センチメートルの作品は、一般的に100万初代ヒト中皮細胞（HPMC）20万の一次ヒト線維芽細胞または正常大網線維芽細胞（NOF）が得られます。
    2. 組織が3用0.5×gで中に浸漬したPBSをスピンダウン分できるだけ早く採取後（PBS中<2時間）、50mlのコニカルチューブに新鮮な20ミリリットルのPBSに組織を移します。直径15cm、無菌培養皿（ 図2B）にメスで切り刻むことによって5ミリメートル3個に組織をカット。
  2. 初代ヒト中皮細胞の単離8
    1. HPMCを単離するために、50mlコニカルチューブにみじん切りの組織を転送し、固体片がトップ（ 図2C＆D）に浮動するために1分を待ちます。 HPMCおよび赤血球（RBC）は、底部に液体中に存在するであろう。チューブの底から、新しいコニカルチューブに液体を除去するために、ピペットを使用してください。 3分間0.5×gで液体をスピンダウンし、HPMC / RBCペレットから上清を吸引除去します。
      1. プロセスを3回繰り返します。組織は、上昇ピペットでおよびHPMC / RBC管に底から液体を除去、スピンダウン、および削除することができ、みじん切り組織に20ミリリットルのPBSを追加上清。すべてのスピンが完了し、上清を吸引した後、ペレットは、HPMCおよびRBCを含みます。
    2. プレート10％ウシ胎児血清[FBS]、1％MEMビタミン[93ミリグラム/ L]、1％MEM非必須アミノ酸[81.4との完全成長培地15mlの（DMEM中で75cm 2のフラスコ中に、ペレットから全セルMG / L]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]）。
    3. 追加のHPMCを分離するために、二次PBS洗浄を行ってください。
      1. 組織はトップにフロートするために二PBS洗浄のため、200 rpmで、20mlのPBSで10分間、37℃で、残りの固形組織を振る、その後、1分待ちます。 、新しいチューブに、チューブの底部から液体を除去する3分間の0.5×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。
      2. 二PBSのプレートのすべてのHPMC / RBCが完全増殖培地15ml中の別々の75cm 2のフラスコ中で洗います。
    4. 任意のRを単離するために、ボリュームによってPBS溶液：1、0.25％トリプシンの25mM EDTA：HPMCをemaining、1 20mlに10分間、200 rpmで37℃の度を細分化した組織を横に振ります。組織が上昇することを許可する、新しい50mlチューブにチューブの底に液体を収集し、0.5 GX 3分でスピンダウン。
      1. 上清を吸引除去し、完全増殖培地15mlに別々の75cm 2のフラスコ内のすべてのHPMC / RBCをめっき。
    5. 培養メッキ37℃で細胞を加湿環境下で5％CO 2。フィードは、使用済み培地を除去せずに3日目および5に完全成長培地を15mlを加えることによって、細胞を播種しました。 HPMCは、分割前に5〜7日間培養することができます。
      1. 元の表現型の脱分化および変更を最小限に抑えるために、すべての実験で（継代2まで）の低継代HPMCを使用してください。位相コントラストcapabilitieプラスチック微分干渉コントラスト機能や4-20x目的とした20倍目的で、好ましくは広視野顕微鏡を使用して、S細胞のすべての画像を撮影する（顕微鏡の位相コントラストフィルタ）、および3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）染色を免疫組織化学的に分析する明視野で10倍対物レンズ（）。
    6. HPMCは立方形であり、免疫組織化学8（ 図3A、C、E）を行うことにより 、サイトケラチン8およびビメンチンを発現することを確認します。
  3. NOF分離8
    1. 1：100Xペニシリン - ストレプトマイシンの1：1混合物をPBS中のヒアルロニダーゼの714単位の活動/ mlのコラゲナーゼタイプIIIの1500単位の活動/ mlの1を組み合わせることにより、コラゲナーゼタイプIII溶液（10倍）の株式の10ミリリットルを準備します。
    2. 1％MEMビタミン[93ミリグラム/ L]で無血清培地で希釈10倍コラゲナーゼタイプIII溶液10ml（DMEM中で6時間、200 rpmでHPMC分離後に残るみじん切り大網組織、37℃を振って、 1％MEM非必須アミノ酸[81.4 mg / Lで]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]）。消化された組織は、不透明になりますし、いくつかの繊維の破片（ 図2E）を有することができます 。
    3. NOF細胞を含有する溶液を遠心 室温で3分間0.5×gで懸濁液中で、上清を吸引し、完全増殖培地13ミ ​​リリットルで75cm 2のフラスコ中でペレットをプレート。
    4. 古いメディアを削除し、24時間後に、新鮮な完全増殖培地15mlで交換してください。 NOFは、分割前に1-3日間培養することができます。細胞がコンフルエントに達したときにNOFの注意増殖が停止します。
    5. 一次ヒト線維芽細胞は平坦であることを確認し、細長い細胞およびビメンチンを発現するが、免疫組織化学8（ 図3B、D、F）を行うことにより 8サイトケラチンありません。脱分化を最小限にするために（理想的に継代3前）の実験のための低通路NOFを使用します そして、元の表現型の修正。細胞の全ての位相画像を撮影するためのプラスチック製のDIC機能を搭載した20倍目的で広視野顕微鏡を使用して、と明視野で10倍の目的は、免疫組織化学的DAB染色を分析します。

2.メッキ器官培養8

  1. わずか5分3ミリリットル0.25％のトリプシン/ 25mMのEDTAに続いて10mlのPBSですすいで75センチ培養フラスコからリリースNOF。完全増殖培地の少なくとも3倍のボリュームで、トリプシンを中和します。
  2. 50mlコニカルチューブにトリプシン処理した細胞を移し、0.5 GX 3分でスピンダウン。上清を除去し、完全増殖培地5mlにまで戻って細胞をもたらします。培養フラスコから回収した細胞をカウントするセルカウンタを使用してください。
  3. 黒、透明底、96ウェルプレートに100μlのあたり2,000〜4,000 NOFをプレートに完全増殖培地の適切な量で細胞を希釈します。メッキ前に、細胞混合物をラット尾コラーゲンI0.5μgの/ 100μLを加えます。細胞は、少なくとも4時間、加湿環境において、または細胞になるまで5％CO 2中で37℃で放置プレート表面に付着します。
  4. ステップ2.1および2.2に記載したのと同じ方法を用いて培養フラスコからHPMCを解除してください。すでに96ウェルプレート中のI型コラーゲンでメッキNOFの上に50μlのあたり10,000〜20,000 HPMCをプレートに完全増殖培地の適切な量で細胞を希釈します。細胞は、実験を開始する前に、少なくとも18時間、加湿環境で、5％CO 2中、37℃で座ってみましょう。
  5. 完全な増殖培地でHeyA8卵巣癌細胞を発現性培養緑色蛍光タンパク質（GFP）。 HeyA8卵巣癌細胞を蛍光カイアシ類CGFP（pCDH-CMV-MCS-EF1）を発現するレンチウイルスベクターの発現によって標識されています。 HeyA8卵巣癌細胞は、使用日の80〜90％コンフルエント（対数増殖期）でなければなりません。培養プレートから細胞を離し、初代培養細胞のためのステップ2.1から2.2に記載したのと同じ方法を使用してカウントします。
  6. 卵巣癌細胞を、37℃で15〜20分間、完全増殖培地中で回復させます緩く密封された蓋付きの円錐管。

3.接着アッセイ8

  1. 回収後、0.5×gで3分間回転させることにより卵巣癌細胞をペレット化し、上清を除去し、50,000細胞/ 100μlの濃度を達成するために、無血清培地の適切な量で細胞を希釈します。
  2. 使用済み培地を除去し、各ウェルに無血清培地中の癌細胞懸濁液100μlを追加するHPMC / NOF器官培養物を96ウェルプレートを反転します。 4時間30分間、加湿環境中、5％CO 2中37℃でプレートをインキュベートします。
  3. 培地および非接着細胞を除去するために、96ウェルプレートを反転させます。慎重に、ゆっくりと各ウェルに100μlのPBSをピペット、再度プレートを反転させるために、低電力でマルチチャンネルピペットを使用してください。 PBSで一回以上の洗浄を繰り返します。
  4. PBSを除去し、各ウェルに100μlの4％パラホルムアルデヒドを添加することが反転します。プレートは、20マイルのために座ってできるようにします細胞を固定する場合は、N。 20分後、プレートを反転し、100μlのPBSを追加します。
  5. ウェルの総蛍光を報告することができるか、細胞の数を定量することができることに留意されたいです。定量化のために、100万細胞/ mlの濃度でHeyA8細胞を用いて、重複の最初のプレートの標準曲線。
    1. 、ダウン100万個の細胞をスピン培地を除去し、それらを20分間1ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド中で座ってできるようにすることで、標準曲線を作成します。
    2. 再び細胞をスピンし、1mlのPBS（再集計セルが100万/ mlの濃度を確認するために）で起動します。連でプレートそれぞれに50,000、40,000、30,000 20,000 10,000 5000 1000、および0細胞だけでなく、各ウェルに50μlの最終総容量をPBSを追加します。
  6. ボトムは高いウェル（標準曲線上で50,000）をスケーリング、蛍光プレートリーダー（励起= 488nmで、放射= 528 nm）の上で培養プレートをお読みください。 organotypに付着何卵巣癌細胞を計算するために、標準曲線を使用して各ウェル（ 図4A-C）におけるIC文化。

4.増殖アッセイ10

  1. 卵巣癌細胞を、0.5×gで3分間回転させることによって細胞をペレット化（工程2.5および上記2.6を参照）を回収した後、1％のFBS、1％MEMと1％FBS培地の適切な量（DMEMで細胞を希釈した後に4000細胞の濃度を達成するために、ビタミン[93ミリグラム/ L]、1％MEM非必須アミノ酸、[81.4ミリグラム/ L]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]） / 150μL。
  2. 使用済み培地を除去し、各ウェルに1％FBS培地中の癌細胞懸濁液の150μlを添加するHPMC / NOF器官培養物を96ウェルプレートを反転します。 72時間加湿環境で、5％CO 2中、37℃でプレートをインキュベートします。
  3. ボトムは、相対的な増殖を評価するために、一日一回（励起= 488nmで、= 528 nmの発光）蛍光プレートリーダー上で培養プレートを読みます細胞の。 48時間（ 図5A-C）でメディアを変え、96時間アッセイを続行します。 （プレートが望ましい反転）のメディアを変更する際の文化を乱さないように注意してください。

5.浸潤アッセイ8

  1. 3D培養をメッキする前に、24ウェル培養プレートインサート（8μmの孔径）に200μlのPBS中7.5μgのラット尾コラーゲンIを追加します。プレートをインキュベートするO / Nが、その後慎重にすぐにコラーゲン被覆インサート（上記のステップ2）にHPMC / NOFの器官培養液をメッキする前にピペットでPBSを削除してみましょう。
  2. ステップ3.1のように卵巣癌細胞を準備します。インサートの器官培養物に卵巣癌細胞をプレートに、慎重にインサートの上部から余分なメディアを削除するには、ピペットを使用しています。各ウェルに無血清培地中で卵巣癌細胞懸濁液100μlを加えます。
  3. で癌細胞を誘導するために十分に挿入下に完全成長培地750μlのを追加器官培養物にvasion。 24時間加湿環境で、5％CO 2中、37℃でプレートをインキュベートします。
    注意：器官培養物が挿入を渡り、インサートの底面に残る侵入卵巣癌細胞を。
  4. 空のウェルに挿入を移動した後、24時間後、トングと挿入を把握し、簡単に、PBSのビーカーでそれをすすいでください。 1分の合計のための綿棒の両側に各インサートの上部をスクラブ。すばやく各ウェル中の750μlの4％パラホルムアルデヒドを含むプレートにカバーを置きます。各インサートは750μlのPBSで満たされたウェルへの挿入を転送する前に、10分間パラホルムアルデヒド中で座ってできるようにします。
  5. 2.5倍の倍率で顕微鏡で浸潤した細胞（インサートの底部に接着固定）を表示します。ウェル全体が視野内にある場合、回避、10倍に倍率を調整し、5写真、ウェルの各象限における中央付近の1と1を取りますエッジに近すぎる画像を撮影します。各ウェルについての同じパターンに従ってください。
  6. そのプロトコルに従って、各ウェル内のフィールドごとに浸潤した細胞の平均数（ 図6A-C）を取得するには、各画像内のセルの数をカウントするために、製造元のプログラムを使用します。

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結果

器官培養物を、最初にI型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞を混合した後、中皮細胞の5倍の数でこの文化を重ねることによって組み立てました。卵巣癌細胞の接着、浸潤または増殖を研究するために追加された前培養物を少なくとも18時間インキュベートしました。各アッセイは、複数を繰り返した（N = 5）及び浸潤アッセイ（N = 3）（N = 3~5）の異なる患者及び多数のウェルから得られた三次?...

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ディスカッション

腹膜微小環境の器官モデルは、卵巣癌の普及における微小環境の細胞と生来のコンポーネントの両方の個人や集団の機能（複数可）を評価するために設立されました。卵巣癌細胞の接着、増殖、および浸潤を調べるために、3次元器官型培養物をプレーティングし、カスタマイズするための特定のプロトコルが提供されます。初代ヒト大網中皮細胞及び線維芽細胞は、患者から単離し、正常な...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

参考文献

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