JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

要約

塩分は水生環境の重要な特徴です。水生生物にとっては、淡水、汽水、海水の生息地を定義します。化学物質や水生生物への生態リスクの評価の毒性のテストは頻繁に淡水で実行されますが、水生生物への化学物質の毒性はpH、温度、および塩分濃度に依存します。何の方法は、水生生物への毒性の塩分濃度依存性を試験するために、しかし、ありません。彼らは淡水、汽水、海水に適応することができますので、ここでは、メダカ（ メダカ）を用いました 。胚飼育培地（ERM）の異なる濃度は、（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、および30倍）が卵をメダカする銀ナノコロイド粒子（SNCが）の毒性を試験するために使用した（1×ERMと30X ERMは、浸透圧相当を持っています）は、それぞれ、淡水と海水へ。 6ウェルプラスチックプレートでは、三連で15メダカの卵は、10mg / L＆でのSNCにさらされました＃8722;暗所でpH7のERMの異なる濃度で1〜25°C。

私たちは、日（セクション4）の孵化に6日目に15秒、眼の直径あたりの心拍数と幼虫のフルボディの長さを測定するために解剖顕微鏡やマイクロメーターを使用していました。胚を孵化または14日目まで観察されました。私たちは、その後、14日（第4章）のために毎日孵化率を数えました。胚における銀の蓄積を確認するために、我々は銀のテスト・ソリューション（第5節）の濃度とdechorionated胚（セクション6）明らかに増加塩分濃度とともに増加したメダカ胚へのSNCの選択図毒性を測定するために、誘導結合プラズマ質量分析法を使用していました。この新しい方法は、異なる塩分中の化学物質の毒性を試験することを可能にします。

概要

1979年の試験化学物質のための経済協力開発機構（OECD）の試験のガイドラインについては組織の設立以来、38テストガイドラインはガイドライン、生物的システム1への影響の第2節で公開されています。テストした水生生物のすべては、淡水の生息地、すなわち淡水植物からなっています。藻類;このようなミジンコやユスリカなど無脊椎動物。そして、このようなメダカ、ゼブラフィッシュ、およびニジマスなどの魚。塩水環境と比較して、淡水環境はより直接的に人間の経済・産業活動の影響を受けています。彼らは汚染からリスクが高いので、したがって、淡水環境は、テストのために優先順位付けされています。

河口などの沿岸地域では、塩分は汽水や海水条件の間で変動し、これらの領域は、多くの場合、産業活動2によって汚染されています。沿岸地域とそれに関連する湿地は、時間によって特徴付けられます生態系の生物多様性と生産性IGH。沿岸の生態系は、したがって、化学物質汚染から保護されなければなりません。しかし、汽水、海水の生息地での限られた環境毒性学の研究がなされてきました。

Sakaizumi 3は、日本のメダカの卵中のメチル水銀と塩分との間に毒性の相互作用を研究し、試験溶液の浸透圧を増加させることがメチル水銀の毒性を増強することを見出しました。炭谷ら 4は、埋立地浸出水の毒性を調べるために、メダカの卵を使用。彼らは卵への浸出水の浸透等価が胚形成中に異常を誘発するための鍵であることがわかりました。また、柏田5は、プラスチック製のナノ粒子（直径39.4 nm）と簡単に塩気の条件の下でメダカ卵の漿膜（15X胚飼育培地（ERM））を透過していることを報告しました。

典型的な小魚モデル、日本のメダカ（ メダカ ）基礎生物学および生態毒性6で使用されてきました。日本のメダカは、その高度に発達した塩化セル7の淡水から海水までの条件で生きることができます。したがって、それらは、塩分の広い範囲の条件で試験するために有用である可能性があります。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

本研究で用いたメダカは、苦痛や不快感の軽減に配慮し、東洋大学の制度ガイドラインに従って人道的に処理しました。

1.シルバーナノコロイド（SNCが）

  1. 精製されたのSNCを購入した（20mg / L -1、純度99.99％、粒子は、蒸留水に懸濁28.4±8.5 nm程度の直径を意味します）。
  2. 誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により、銀の純度および濃度を検証するには、取扱説明書8に記載の分析します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。

SNCソリューション異なる塩分と（シルバーコロイドとAg +の混合物）の調製

  1. 60グラムのNaCl、1.8グラムのKCl、2.4グラムののCaCl 2・2H 2 O、およびULTの1L中9.78グラムのMgSO 4・7H 2 Oからなる60×ERMを準備rapure水;超純水中の1.25％NaHCO 3でpHを7.0に調整します。
  2. 一晩25℃でのERMソリューションをかき混ぜます。
  3. 希釈したERMとのSNCを混ぜます。各SNC-ERM混合溶液40mlを準備します。最終濃度は、ERMの異なる濃度でのSNCの10 mg / Lで-1である（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍）。
  4. 超純水中の0.625パーセントのNaHCO 3で7.0にSNC-ERM混合溶液のpHを調整します。 Ag +放出は酸性条件9により促進されるため、pH調整は、SNCの溶液を調製する際に非常に重要です。
  5. SNCのための参照化合物としてのAgNO 3を使用してください。
    1. 希ERMとのAgNO 3を混ぜます。 15.7 mg / LでのAgNO 3濃度でのAgNO 3 -ERM混合溶液の40ミリリットルを準備-1 ERMの異なる濃度で（10 mg / Lで-1銀）（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍） 。
      注：銀コロイド毒性を調べるために、 硝酸銀可溶性銀の供給源である溶液を、銀コロイドと可溶性銀の混合物であるのSNCのための参照化合物として使用されます。

3.メダカ文化と卵の収穫

  1. メダカ（O.のメダカ ）（橙赤色株）（60人の男性と60人の女性）を取得します。
  2. メダカフロースルー培養系を用いて、3 Lタンク内の1倍ERMで（1グループとして20人の男性と20人の女性）グループなどの文化メダカ。
    1. 以下の条件での文化：
      培養液のpH範囲：6.2〜6.5
      光：暗サイクル：16：8時間
      培養液の温度：24±0.5°C
      培地の浸透圧：257ミリオスモル
  3. （1日5回）（一日一回）10:00にアルテミア・サリナノープリウスにメダカをフィードし、午前9時、11時、午前13時、午後03時、および17時に人工乾燥魚食を食べます。
    1. Aを得ました。サリナノープリウス。
    2. プラスチックビーカー中の3.0％塩溶液の5 Lを準備します。
    3. ビーカー内の塩溶液にブラインシュリンプの卵の30グラムを追加します。
    4. 曝気ポンプを用いて、（4 L /分-1）を吹き込みながら48時間、25℃で卵をインキュベートします。
    5. 48時間後、バブリングを停止します。
    6. 解決策は、斜線のA.を分離するために5〜10分間放置します未孵化卵や卵の殻（溶液の上部）からサ ​​リナノープリウス（溶液の下部）。
    7. デカンテーションにより溶液の上層を削除します。
    8. 283ミクロンの開口部を有するふるいを通してソリューションの下部をフィルタし、198ミクロンの開口部がネット上を通過ノープリウスを収集します。
    9. 6時間以内にメダカにノープリウスを養います。
  4. 女性のメダカが生み出した後、メスの体からそっと外部卵クラスタを削除するか、SMを使用して水槽の底から卵を集めますすべてのネット（正味サイズ5センチメートル×5センチ、穴の大きさ0.2ミリメートルX 0.2ミリメートル）。
  5. 5秒間水道水を流しながら卵のクラスタをすすぎます。
  6. 30倍ERM溶液にすすぎ卵クラスターのすべてを追加します。
  7. 1分後に溶液からクラスタを削除して、乾いたペーパータオルとロールとの間に卵のクラスタを配置します。
  8. 30倍ERMに戻って卵を入れてください。
  9. 解剖顕微鏡下で受精卵を選択します。
  10. 鉗子を用いて、6ウェルプラスチックプレートに1×ERMで選択した810卵を置きます。
  11. 21.発達段階までインキュベーター中に25±0.1℃で卵をインキュベート（メダカ胚の発達段階は岩松10の仕事から定義されていました。）
  12. 解剖顕微鏡下で発達段階21でインキュベートした卵を取り出します。
  13. 1倍ERMで選択した卵をすすぎます。
  14. 曝露実験（セクション4）にすすいで卵をかけます。

4.毒性のSNCの試験または硝酸銀 別のERMの塩分で

  1. メダカの卵をすすぐ（ステージ21）試験溶液[SNCは（10 mg / Lの-1）または硝酸銀で3回ERMの各濃度（1×、5×で（15.7 mg / Lで-1は10mg / L -1銀など） 、10倍、15倍、20倍、または30倍）pH7の]。対照として、pH7で30×ERMに1×で卵を使用しています。
  2. 6ウェルプラスチックプレートの各試験溶液5mlに15すすい卵を加えます。 （各試験液を使用してSNCかのAgNO 3毒性試験のための露光実験三回実行）。
  3. アルミホイルでプレートを包みます。
  4. 孵化するまで、または14日間暗所で25℃で包まれたプレートをインキュベートします。
  5. 生物学的変化と死んだ卵のために露出卵ごとに24時間を守って（ 図1および図 2）。
  6. 試験溶液を24時間毎に交換します。
  7. 次のように観測を行います。
    1. 曝露の6日目に、O（15秒ごとに）心拍数を数えますストップウォッチ（ 図3a）を用いて、解剖顕微鏡下でのFメダカ胚。
    2. 曝露の6日目に、マイクロメーター（ 図3b）を使用して、解剖顕微鏡下でメダカの胚の眼の大きさ（直径）を測定します。
    3. 孵化日に、マイクロメーター（ 図3c）を使用して、解剖顕微鏡下で幼虫のフルボディの長さを測定します。
    4. 14日（ 図3d）の上に孵化露出した卵の総数をカウントします。

5. SNC溶液からの可溶性銀の単離、およびシルバー分析

  1. 14,000 xで3 kDaの膜フィル​​ターを通して濾過することにより、各SNC液（銀コロイドと可溶性銀の混合物）から水溶性銀を分離 gで10分間4°C。 1×ERM中の凝集のSNCの報告平均直径は67.8 nmの11であるため、SNCのから水溶性銀を分離するために3 kDaの膜フィルターを使用しますNDのAg +のそれは0.162 nmの12です。 3 kDaの膜が2nm以上13の直径を有する粒子を除外します。
  2. ICP-MS取扱説明書8に記載の ICP-MS分析（ 図3E）により濾過した溶液の50μl中銀濃度（=可溶性銀濃度）を測定します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。

メダカ胚におけるシルバー生物蓄積の6.測定

  1. セクション4で説明したようにSNCのかのAgNO 3にメダカの卵（ステージ21）を公開します。
  2. 曝露の6日目に、 メダカブック 14に記載のプロトコルに従って酵素を孵化メダカを用いて、卵（ すなわち 、dechorion）から絨毛膜を除去します。
  3. ICP-MS取扱説明書8（ 図3F）に応じてICP-MS分析によりdechorioned卵の銀濃度を測定します。前処理ICP-MS分析のための方法は、第7章に記載されています。

ICP-MS分析による銀濃度の7.測定

  1. （;セクション1の銀濃度の検証のための）サンプル[銀溶液50μlを追加します。 3 dechorionated胚（第5節）。または50ミリリットルのテフロンビーカーに濾過した溶液を50μl（セクション5）]。
  2. 50ミリリットルのビーカーに超純硝酸の2.0ミリリットルを追加します。
  3. それは（約3時間）乾く直前まで110℃のホットプレート上で混合物を加熱します。
  4. 完全に有機物を溶解するために、ビーカーに超純硝酸と過酸化水素の0.5ミリリットルの2.0ミリリットルを追加します。
  5. それは（約3時間）乾く直前までホットプレート上で再び混合物を加熱します。
  6. 1.0％超高純度の硝酸溶液4mlに残留物を溶解します。
  7. 転送遠心チューブに溶液4ml。
  8. （3回の合計）を2回7.7から7.6を繰り返します。最終容量は12.0ですミリリットル。
  9. 取扱説明書8に記載のICP-MS分析を用いて（1.0％超純粋硝酸に溶解した）サンプルの銀の濃度を測定します。
    1. 内部および外部の標準液を使用して銀濃度を定量化するために（ 物質 一覧を参照してください）。内部および外部標準溶液は米国試験所認定協会（A2LA）の認定を受けています。銀の検出限界は0.0018 ng / mlで-1（溶液）と0.016 ngのMG-重量-1（胚体）でした。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

SNCの毒性に対する塩分の影響は非常に明白であった：奇形や死の誘導は、塩分濃度依存（ 図1および図 2）でした。我々は（10 mg / Lで-1）-exposed胚SNCで表現型のバイオマーカー（心拍数、アイサイズ、フルボディの長さ、および孵化率）を測定しました。これらの表現型のバイオマーカーは、塩分濃度依存SNC毒性を明らか?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

メダカは、海水に対して非常に寛容である淡水魚です。よくこの魚の本来の自然の生息地は、日本の沿岸6オフ海水だったことは知られていません。したがって、メダカは塩化セル7よく発達してきました。このユニークなプロパティは、魚の単独種のみを使用して、塩分（海水への淡水）の関数として、環境中の化学物質の毒性を試験するための新しい方法で科学者を提供し?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Silver nanocolloidsUtopia Silver Supplements
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45For making ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85For making ERM
CaCl2·2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15For making ERM
MgSO4·7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85For making ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25For making ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH meterHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strainNational Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing systemMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggsJapan pet design Co. Ltd4975677033759
aeration pumpJapan pet design Co. Ltdnon-noise w300
Otohime larval β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdOtohime larval β-1Artificial dry fish diet
dissecting microscopeLeica microsystemsM165FC
micrometerFujikogaku, Ltd.10450023
incubatorNksystemTG-180-5LB
shakerELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
6-well plastic platesGreiner CELLSTARM8562-100EA
aluminum foilAS ONE Co.6-713-02
stopwatchDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
3 kDa membrane filterEMD Millipore Corporation0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beakerAS ONE Co.33431097
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-538For internal standard
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-622For external standard
ultrapure nitric acidKanto Chemical Co.28163-5B
hydrogen peroxide Kanto Chemical Co.18084-1Bfor atomic absorption spectrometry
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
hot plateTiger Co.CRC-A300

参考文献

  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

109 nanotoxicology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved